微生物和化学刺激诱导的中性粒细胞胞外陷阱的形态学和组成分析

该协议证明了中性粒细胞细胞外陷阱的组成，结构和形态的异质性，这取决于它们在健康个体的人中性粒细胞的可比体外条件下的诱导刺激。获得高中性粒细胞纯度和活力。这允许比较中性粒细胞细胞外陷阱释放的DNA，LL-37和髓过氧化物酶，弹性蛋白酶和组织蛋白酶G的酶活性的浓度。

该协议允许分析可溶性因子或细胞接触或可能的疗法或关闭自身免疫性疾病中NETs产生机制的影响。这些方法可以帮助检查自身免疫性疾病。由于NET的不受控制的细胞繁殖和对齐其成分的持续时间，这被认为是疾病的生物标志物。

荧光显微镜允许捕获NET的图像，显示与蛋白质（如LL37）相关的DNA分散，LL37与微生物共定位，有助于了解它们的外观。首先，进行静脉穿刺以在含有EDTA二钾作为抗凝剂的管中收集10毫升外周血。然后进行标准的血液生物测定和C反应蛋白测试，以排除感染或炎症，以确保样本的质量。

离心外周血样品以去除富含血小板的血浆，然后进行第二次离心并丢弃剩余的血浆。用一个 1X DPBS 以一比一的体积比稀释所得的红细胞和白细胞包。然后，在无菌的10毫升玻璃管中，首先沉积一毫升1.08克/毫升密度溶液，然后一毫升1.079克/毫升密度溶液。

然后，倒在壁上，加入四毫升稀释的红细胞和白细胞包装。离心机不加减速，以免干扰梯度。吸出对应于粒细胞的相，并转移到另一个无菌的10毫升玻璃管中。

用4毫升1X DPBS在300G下在4摄氏度下洗涤10分钟，弃去上清液。为了去除剩余的红细胞，通过加入四毫升0.2%盐水溶液来用渗透休克处理细胞。在四摄氏度下孵育两分钟并离心。

弃去上清液，加入四毫升0.65%盐水溶液。在 4 摄氏度下孵育五分钟以恢复膜完整性并重复离心。除去上清液并将细胞重新悬浮在四毫升1X DPBS中以除去细胞碎片。

再次，离心并将细胞沉淀重新悬浮在两毫升冷HBSS缓冲液中。要进行台盼蓝排除试验，请将5微升细胞悬液稀释在20微升0.4%台盼蓝中。在新的鲍尔室中计数细胞，并使用排除测试确定细胞活力。

然后，将5微升细胞悬液安装在载玻片上，并用Wright的染色剂染色15秒。立即固定样品，用蒸馏水洗涤，并在光学显微镜下观察形貌。接下来，向第五个细胞中加入1乘以10倍到流式细胞术管中，并在黑暗中用1微升7AAD在100微升FACS缓冲液中染色15分钟。

用 500 微升 FACS 缓冲液以 300 G 洗涤 10 分钟。用500微升2%多聚甲醛固定细胞，并储存在4摄氏度直至流式细胞术分析。对于死细胞对照，用200微升4%多聚甲醛固定细胞30分钟，并在4摄氏度下用500微升1XPBS在300G下洗涤10分钟。

弃去上清液，加入200微升0.1%Triton X-100。在四摄氏度下孵育一小时。用 500 微升 1X PBS 洗涤，并用 7AAD 染色。

在流式细胞仪软件中分析捕获的数据。加载文件并双击未染色的中性粒细胞文件。在 X 轴上选择前向散射或 FSC，在 Y 轴上选择侧向散射或 SSC 以显示与中性粒细胞对应的细胞群。

然后在X轴上选择通道B3-A:PerCP vio 700-A以取消细胞的自发荧光的限制，并在Y轴上选择直方图。然后，打开染色的中性粒细胞文件。在 X 轴上选择 FSC，在 Y 轴上选择 SSC 以显示与中性粒细胞对应的细胞群。

再次选择通道B3-A:PerCP vio 700-A以限定染料7AAD阳性的中性粒细胞群体。通过右键单击窗口并选择复制到布局编辑器来生成最终直方图。在1.5毫升微管中加入细菌或真菌假菌丝。

加入 200 微升，即在 1X PBS 中加入 5 微摩尔 CFSC。混合并在 37 摄氏度下在黑暗中孵育 10 分钟。通过加入500微升去补体血浆和离心机来停止反应。

弃去上清液，用一毫升1XPBS离心洗涤沉淀。然后将微生物重新悬浮在250微升1X PBS中。在 1.5 毫升微管中制备 50 微升等分试样，用两倍 10 至第七个细菌或两倍 10 至第五个假菌丝进行 NET 诱导。

将 10 x 10 毫米无菌玻璃盖玻片放入 24 孔板中。在室温下用 10 微升 0.001% 聚 l-赖氨酸覆盖一小时，并用 100 微升 1X PBS 洗涤两次。风干并用紫外线照射15分钟。

接下来，用补充有10%热去补体自体血浆的RPMI 1640培养基替换先前制备的中性粒细胞悬浮液的HBSS溶液。将350微升该细胞悬液加入24孔板中，使终浓度为每孔第5个中性粒细胞的10倍的两倍。将板在37摄氏度下用5%二氧化碳孵育20分钟，以使细胞粘附在孔底。

为了诱导网形成，在MOI1处添加细菌刺激MOI100和假菌丝。同时加入生化刺激物，并通过加入50微升HBSS来制备没有刺激的对照。获得每孔400微升的最终体积，并在140RPM的摇板器上混合30秒。

然后在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 4 小时。净诱导后，小心移液从孔中除去上清液，并用300微升4%多聚甲醛固定细胞30分钟。用200微升1X PBS洗涤细胞而不离心，并加入200微升封闭缓冲液30分钟。

对于LL37染色，用200微升0.2%Triton X-100在1X PBS中透化细胞10分钟，并用1X PBS洗涤两次。将盖玻片安装在载玻片上。DNA用两微升DAPI染色细胞，并储存在零下20摄氏度，直到通过共聚焦荧光显微镜进行分析。

双密度梯度纯化后可视化动态细胞相。通过右染色证实典型的中性粒细胞形态。这些细胞还显示出通过台盼蓝排除观察到的最佳活力，而不会破坏膜。

通过流式细胞术对SSC与FSC的分析证实了对应于具有高细胞纯度的PMN的群体。未染色细胞与7AAD染色细胞的PMN点图及其各自的直方图表明，与透化对照细胞相比，新鲜分离的中性粒细胞具有高细胞活力。用化学和微生物兴奋剂刺激中性粒细胞后，使用DNA DPI和抗LL37通过荧光显微镜观察NET。

微生物用CFSE预染色。PMA诱导的自杀网形成，由与LL37共定位指示。而用HOCI形成的NET在细胞外空间中显示出轻微的DNA分散，对应于重要的NET形成。

由真菌假菌导的NET显示出低浓度的DNA释放到细胞外空间，具有重要NET形成的丝状结构特征。金黄色葡萄球菌显示出重要的NET形成，而铜绿假单胞菌诱导释放具有浑浊形态的大浓度DNA，与LL37共同定位，表明自杀NET形成。执行双密度梯度方法使我们能够获得中性粒细胞的高纯度和活力。

我们提升洗涤剂，避免损坏它们的结构。按照这种方法，我们可以分析物质或细胞在NET产生中的作用，以及它们是否参与某种机制或用作自身免疫性疾病的治疗方法。