NETs têm atraído atenção recente, mas quantificar NETs in vivo tem se mostrado desafiador. Esse protocolo fornece um método desejável, altamente sensível e valioso para investigar as características dos TNEs em ambientes clínicos. Essa técnica deve se estender para avaliar a gravidade da sepse ou SDRA séptica, síndrome do desconforto respiratório agudo.
É amplamente aceito que a regulação de dumps ou padrões moleculares associados a danos é a chave para melhorar a condição clínica da sepse. A maior vantagem deste método inclui a quantificação precisa de remanescentes de NET circulantes como mieloperoxidase-DNA e DNA elastase-neutrófilo em um curto espaço de tempo. É aconselhável girar as amostras antes do ensaio e evitar descongelamentos repetidos.
É importante seguir os tempos de incubação conforme indicado no protocolo. Comece diluindo neutrófilos polimorfonucleares recém-isolados para 10.000 células por mililitro em RPMI 1640 livre de fenol vermelho. Peneire-os em pratos de cultura de 35 milímetros.
Para induzir armadilhas extracelulares de neutrófilos ou NETs, primeiro estimular os polimorfonucleares neutrófilos com PMA 25 nanomolares. Em seguida, digerir parcialmente as armadilhas extracelulares adicionando 0,6 microgramas por mililitro de DNase I e incubar a mistura por 50 minutos à temperatura ambiente. Agora, adicione EDTA de cinco milimolares para interromper a atividade da DNase e colete o meio que contém as NETs sintetizadas.
Centrífuga para remover os detritos celulares. Colete os sobrenadantes de quatro controles saudáveis. Misture-os a menos 80 graus Celsius para uso posterior.
Pipetar 100 microlitros de antimieloperoxidase diluída contendo 0,05 microgramas do anticorpo para uma placa de ELISA. Agora, cubra a placa com uma tampa plástica adesiva para evitar a evaporação da amostra e incube a amostra durante a noite a quatro graus Celsius para permitir a ligação dos anticorpos de captura. No dia seguinte, descarte a solução de anticorpos diluída dos poços e pipete 300 microlitros de solução de lavagem em cada poço.
Toque o prato seco em um papel toalha para remover o excesso de PBS. Bloqueie cada poço da placa com 200 microlitros do tampão de bloqueio. Cubra-o com uma tampa plástica adesiva e obstrua os poços incubando-o.
Depois de descartar a solução de bloqueio dos poços e lavar o prato de três a quatro vezes, seque-o em um papel toalha. Em seguida, pipetar 25 microlitros de plasma em todos os poços, exceto o branco. E diluir com 75 microlitros de PBS, fazendo com que o volume final do poço seja de 100 microlitros.
Em seguida, adicione 100 microlitros de PBS ao poço em branco. Misturar as amostras colocando a placa num agitador durante 10 segundos a 250 rpm à temperatura ambiente. Adicione dois microlitros de 100 DNase I totalmente diluída em todos os poços e coloque a placa selada no agitador por 10 segundos para misturar bem as amostras.
Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente. Adicione um microlitro de EDTA 0,5 molar a cada poço para interromper a reação da DNase. Em seguida, coloque a placa selada no agitador por 15 segundos para misturar bem as amostras.
Finalmente, incube a placa durante a noite a quatro graus Celsius para permitir que os componentes proteicos das NETs se liguem aos anticorpos de captura. No dia seguinte, descarte a solução dos poços. Após várias lavagens de poços, pipetar 100 microlitros do anticorpo anti-detecção de DNA conjugado com peroxidase diluído em cada poço.
Incubar a placa por 1 hora e meia e, em seguida, descartar a solução nos poços. Depois de lavar os poços três vezes, pipetar 100 microlitros de solução de substrato ABTS em cada poço e incubar a placa selada em um agitador no escuro. Pare a reação adicionando 50 microlitros de ácido sulfúrico de dois molares.
Misture o conteúdo do poço batendo cuidadosamente nas laterais da placa. Em seguida, conecte o leitor de microplacas ao computador e inicie o aplicativo de software. Na barra de status, crie um novo experimento e nomeie-o.
Em seguida, defina os parâmetros de leitura da placa selecionando Absorbância como o tipo de leitura, Ponto de extremidade como o modo de leitura e dois como os comprimentos de onda. Em seguida, defina lambda um como 405 nanômetros, lambda dois como 490 nanômetros. Agora, selecione o status Desativado para Automix e Blanking, mantendo a AutoCalibração como On.Em seguida, selecione Ler chapa inteira em Tiras.
Finalmente, defina a Prioridade do Comprimento de Onda da Coluna com Normal como a Velocidade do Carro e selecione Desativado em Leitura Automática. Coloque bem a placa na gaveta do instrumento e feche-a. Clique em Ler para que a placa seja lida imediatamente.
Leia a absorbância de cada poço a 405 nanômetros e realize a subtração automática da absorbância do meio de ensaio de todas as amostras desconhecidas. Curvas padrão confiáveis de calibração foram obtidas para MPO-DNA e NE-DNA quando os valores de absorbância não excederam 0,93 e 0,9, respectivamente. A maior DO foi obtida quando se aplicou 0,6 microgramas por mililitro de DNase I.
Os coeficientes de variabilidade interensaio para os complexos em controles saudáveis foram 1,871 e 0,987, respectivamente, enquanto os pacientes COVID-19 mostraram coeficientes de variabilidade de 2,532 e 2,010, respectivamente. Os coeficientes médios de variabilidade interensaio para MPO-DNA e NE-DNA foram 6,524 e 4,389, respectivamente. A especificidade dos anticorpos de captura para os complexos MPO-DNA e NE-DNA mostrou que os anticorpos de controle do isotipo reagiram pouco aos complexos.
A porcentagem de ambos os complexos foi maior no plasma de pacientes com COVID-19 em relação aos controles saudáveis. O tempo de digestão da DNase deve ser otimizado, caso contrário, a digestão excessiva reduzirá a absorbância.
