尼罗罗非鱼肠单细胞悬液制备用于单细胞测序

该方案为从尼罗罗非鱼肠道制备高质量单细胞悬液提供了可靠的参考，以促进水产养殖鱼类的单细胞水平研究。该技术非常高效，可以在大多数实验室条件下实施。它减少了为水产养殖鱼类制备单细胞悬浮液的额外试验的需要。

首先在充气良好的无菌水中冲洗六个月大的尼罗罗非鱼15分钟，以洗去表面松散结合的细菌。为了制备酶细胞解离试剂，将PBS中的胶原酶分散酶稀释至每毫升1毫克的最终浓度。混合95%体积的制备的酶溶液和5%体积的FBS。

然后在使用前将离心机预冷至四摄氏度。对于组织解剖，将安乐死的鱼放在冰上，收集肠中段三到四厘米。用镊子切除脂肪和肠系膜。

去除附着在肠表面的脂肪和弹性和可延展的透明粘膜。使用注射器用无菌冰冷PBS轻轻冲洗肠道碎片，以洗去肠道内容物和粘液。多次洗涤后，将碎片解剖成小块，并将它们转移到含有一毫升冰冷PBS的1.5毫升管中。

将混合物在 300 x g 下在 4 摄氏度下离心五分钟。并用一毫升冰冷的0.08%BSA-DPBS替换上清液。使用玻璃移液管轻轻吸出以重悬组织碎片。

再次洗涤碎片后，除去上清液并加入一毫升制备的酶解离试剂。同时将五微升RNA抑制剂与解离试剂混合，用于单细胞RNA测序。将试管置于37摄氏度的回火水浴中，并在30至60分钟的孵育时间内每五分钟手动倒置试管。

离心管后，使用宽口径吸头取出酶细胞解离试剂。加入一毫升冰冷的0.08%BSA-DPBS，轻轻上下移液细胞以防止细胞破碎。离心并再次重悬细胞后，将预润湿0.08%BSA-DPBS的40微米细胞过滤器放在50毫升锥形管上。

使细胞悬液通过过滤器。轻敲过滤器，然后用200微升DPBS冲洗，并在管底部收集悬浮液。将悬浮液转移到1.5毫升管中后，加入5微升DNA，并在15至20摄氏度下孵育悬浮液15分钟。

离心后，除去上清液并将细胞沉淀重悬于不含钙和镁离子的400微升冰冷DPBS中。然后用宽口径吸头轻轻上下移液以混合细胞并再次重复此过程。为了染色，将细胞悬液以等比例混合在0.4%台盼蓝溶液中，并在室温下孵育三分钟。

然后在载玻片上加入10微升混合物。在显微镜下计算三个领域的活细胞和死细胞，并计算细胞活力百分比。比较了几种常用酶的解离效率。

经验证，胶原酶分散酶混合物比单独的胶原酶分散酶或胰蛋白酶和其他几种酶混合物具有更好的解离效果。显微镜检查表明，肠道细胞具有较高的活力，并以单细胞形式分散。大多数细胞是活的，而少数细胞由于透化的细胞膜而被染色死亡。

注意所使用的PBS类型。酶消化溶液不能与不含钙/镁的PBS一起使用，因为酶需要钙/镁离子才能有效发挥作用。该程序有助于水产养殖鱼类的单细胞水平研究，为制定水产养殖鱼类的细胞解离方案提供有价值的参考。