Bu protokol, su ürünleri balık türlerinde tek hücreli seviye çalışmalarını kolaylaştırmak için Nil tilapia bağırsağından yüksek kaliteli tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için güvenilir bir referans sağlar. Teknoloji son derece verimlidir ve çoğu laboratuvar koşulunda uygulanabilir. Su ürünleri yetiştiriciliği balık türleri için tek hücreli süspansiyonlar hazırlamak için ek denemelere olan ihtiyacı azaltır.
Altı aylık Nil tilapia balığını, gevşek bir şekilde bağlanmış bakterileri yüzeyden temizlemek için iyi havalandırılmış steril suda 15 dakika durulayarak başlayın. Enzimatik hücre ayrışma reaktifini hazırlamak için, PBS'deki kollajenaz dispazını mililitre başına bir miligramlık nihai bir konsantrasyona seyreltin. Hazırlanan enzimatik çözeltinin% 95 hacmini ve% 5 FBS hacmini karıştırın.
Daha sonra santrifüjü kullanmadan önce dört santigrat dereceye kadar önceden soğutun. Doku diseksiyonu için, ötenazi yapılan balıkları buzun üzerine yerleştirin ve bağırsakların orta bölümünün üç ila dört santimetresini toplayın. Forseps kullanarak yağ ve mezenteri tüketin.
Bağırsak yüzeyine ve elastik ve dövülebilir berrak mukozaya bağlı yağları çıkarın. Bağırsak içeriğini ve mukusunu yıkamak için bir şırınga kullanarak bağırsak parçasını steril buz gibi soğuk PBS ile hafifçe durulayın. Birkaç yıkamadan sonra, parçayı küçük parçalara ayırın ve bir mililitre buz gibi soğuk PBS içeren 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Karışımı beş dakika boyunca dört santigrat derecede 300 x g'de santrifüjleyin. Ve süpernatantı bir mililitre buz gibi soğuk% 0.08 BSA-DPBS ile değiştirin. Bir cam pipet kullanarak, doku parçalarını yeniden askıya almak için nazikçe aspire edin.
Parçaları bir kez daha yıkadıktan sonra, süpernatantı çıkarın ve hazırlanan enzimatik ayrışma reaktifinin bir mililitresini ekleyin. Ayrıca beş mikrolitre RNA inhibitörünü tek hücreli RNA dizilimi için ayrışma reaktifi ile karıştırın. Tüpü 37 santigrat derece temperli su banyosuna yerleştirin ve 30 ila 60 dakikalık inkübasyon süresi boyunca tüpü her beş dakikada bir manuel olarak ters çevirin.
Tüpler döndürüldükten sonra, geniş delikli uçlar kullanarak enzimatik hücre ayrışma reaktifini çıkarın. Bir mililitre buz gibi soğuk% 0.08 BSA-DPBS ekleyin ve hücre bozulmasını önlemek için hücreleri yavaşça yukarı ve aşağı pipetin. Sentrifüzyondan ve hücreleri bir kez daha askıya aldıktan sonra,% 0.08 BSA-DPBS ile önceden ıslatılmış 40 mikrometrelik hücre süzgecini 50 mililitrelik bir konik tüpe yerleştirin.
Hücre süspansiyonunu süzgeçten geçirin. Süzgece dokunun, ardından 200 mikrolitre DPBS ile durulayın ve süspansiyonu tüpün altında toplayın. Süspansiyonu 1,5 mililitrelik bir tüpe aktardıktan sonra, beş mikrolitre DNA ekleyin ve süspansiyonu 15 ila 20 santigrat derecede 15 dakika boyunca inkübe edin.
Santrifüj edildikten sonra, süpernatantı çıkarın ve hücre peletini kalsiyum ve magnezyum iyonları olmadan 400 mikrolitre buz gibi soğuk DPBS'de yeniden askıya alın. Ardından, hücreleri karıştırmak ve bu işlemi bir kez daha tekrarlamak için geniş delikli uçlarla yavaşça yukarı ve aşağı pipet yapın. Boyama için, hücre süspansiyonunu% 0.4 tripan mavisi çözeltisinde eşit oranda karıştırın ve oda sıcaklığında üç dakika boyunca inkübe edin.
Daha sonra cam slaytın üzerine 10 mikrolitre karışım ekleyin. Mikroskop altında canlı ve ölü hücreleri üç alanda sayın ve hücre canlılık yüzdesini hesaplayın. Yaygın olarak kullanılan birkaç enzimin ayrışma etkinlikleri karşılaştırıldı.
Kollajenaz dispaz karışımının, tek başına kollajenaz dispaz veya tripsin ve diğer birkaç enzim karışımından daha iyi bir ayrışma etkisine sahip olduğu doğrulanmıştır. Mikroskobik inceleme, bağırsak hücrelerinin yüksek canlılığa sahip olduğunu ve tek hücre olarak dağıldığını gösterdi. Çoğu hücre yaşayabilirken, birkaçı geçirgen hücre zarı nedeniyle ölü olarak boyandı.
Kullanılan PBS türüne dikkat edin. Enzimatik sindirim çözeltisi, kalsiyum / magnezyum içermeyen PBS ile kullanılamaz, çünkü enzimin etkili bir şekilde çalışması için kalsiyum / magnezyum iyonları gerekir. Prosedür, su ürünleri balık türlerinde tek hücreli seviye çalışmalarını kolaylaştırır ve su ürünleri balık türlerinin hücre ayrışma protokollerini geliştirmek için değerli bir referans sağlar.
