从小鼠颈动脉管腔中分离内皮细胞以进行单细胞多组学实验

在血管中，内皮细胞的数量非常低，这使得研究它们变得困难。我们的协议消除了这一限制，并允许我们研究新的分子途径和治疗方法。我们的协议使我们能够获得富含内皮的样品，并研究急性和慢性紊乱流动如何影响这种细胞类型。

更详细地研究内皮细胞的能力使得确定靶基因成为可能，从而可以确定靶向内皮细胞的动脉粥样硬化的潜在治疗方法。颈动脉隔离很棘手，需要耐心和经验。首先，通过皮下注射每公斤丁丙诺啡0.05毫克来准备动物。

使用Betadine和异丙醇溶液对脱毛区域进行三次灭菌。在颈部区域做一个约一厘米的腹侧中线切口。然后通过钝解剖暴露LCA分支点。

用 6-0 缝合线结扎左颈内动脉、颈外动脉和枕动脉，保持甲状腺上动脉不变。用组织胶或缝合线关闭切口。将鼠标转移到保持在37摄氏度的预热恢复笼中。

将鼠标放在干净的毛巾上长达一小时，以避免手术后体温过低。将 21 号针插入通过心脏顶点连接到左心室的静脉输液管中。在室温下使用生理盐水逆行灌注两到三分钟。

通过在注射或使用静脉输液管时施加稳定的压力来保持恒定的流速，并将盐水袋保持在八到九英尺的高度。从颈部区域去除所有脂肪、肌肉和结缔组织的皮肤，以暴露颈动脉。然后去除颈动脉周围的外周组织，使颈动脉附着在身体上。

在LCA中的结扎部位下方做一个切口以允许灌注。通过左心室再灌注LCA一分钟，以去除任何血迹。用生理盐水溶液清洗颈动脉外部，以去除任何血液痕迹。

使用带有29号针头的胰岛素注射器将50微升消化缓冲液注射到左颈动脉远端的管腔中。使用微夹夹住充满消化缓冲液的颈动脉的近端。在腔内加入 15 至 20 微升消化缓冲液，并夹住远端以避免消化缓冲液的任何释放。

将颈动脉从小鼠转移到含有温热的35摄氏度HEPES缓冲盐水溶液的37毫米培养皿中。并在间歇摇动下在 45 摄氏度下孵育 37 分钟。管腔酶消化完成后，用夹子从35毫米培养皿中取出颈动脉。

小心地拆下夹子，以免消化缓冲液泄漏。将颈动脉的一端保持在 1.5 毫升微量离心管的顶部。通过插入装有胰岛素注射器的 29 号针头，向管腔中加入 100 微升温消化缓冲液。

在微量离心管中快速冲洗颈动脉腔，然后在管中加入0.3微升FBS以停止反应。将微量离心管放在冰上。使用配备固定角度转子的离心机在 500 G 下在 4 摄氏度下离心细胞五分钟并弃去上清液。

将细胞重新悬浮在含有细胞解离试剂的消化缓冲液中，并在37摄氏度下孵育五分钟以将其分离成单个细胞。通过向0.5毫升管中加入0.15毫升FBS来阻断酶促反应，并重复离心。弃去上清液，并将细胞重悬于0.2毫升微量离心管中的PBS中的100微升冰冷的1%BSA溶液中。

对于单细胞分析，将沉淀与100微升冰冷的1%BSA重悬于0.2毫升管中的PBS中。对于单细胞核分析，将细胞沉淀重悬于冰冷的PBS中的100微升0.04%BSA中，并将单细胞悬液在500G下以4摄氏度离心5分钟。用冰冷的裂解缓冲液分解单细胞悬液，并在冰上孵育五分钟。

将裂解物与P20移液管混合，再孵育10分钟。之后，将裂解物转移到0.5毫升管中。用500微升缓冲液洗涤ly细胞，并使用移液管混合。

然后重复离心。弃去上清液，并将细胞核沉淀重悬于150微升稀释的细胞核缓冲液中。使用血细胞计数器计数单核制剂。

在单核测序研究之后，通过明场和相差显微镜获得单细胞和单细胞核并进行可视化。还证明了从单细胞悬液制备单核的效率。经过单细胞RNA测序研究，获得了每个细胞的基因分布、每个细胞的唯一分子标识符、每个细胞的线粒体读数和测序饱和度数据等各种参数。

对于单细胞ATAC序列研究，观察到插入片段尺寸分布，包括核小体条带模式。还观察到标准化的TSS富集评分。此外，百分比片段在峰值中读取。

测定峰区片段、TSS富集评分、黑名单基因组位点读段比和核小体信号比。酶消化对细胞是一种压力，因此将样品保持在冰上并尽快执行该过程至关重要。我们可以使用这种方法从小鼠身上获取和铺板内皮细胞。

我们还可以使用这种技术进行基于Omix的批量研究。该技术为以单细胞方式研究血流紊乱对体内内皮细胞的影响铺平了道路。