Questo protocollo fornisce un riferimento affidabile per la preparazione di una sospensione unicellulare di alta qualità dall'intestino di tilapia del Nilo per facilitare gli studi a livello di singola cellula nelle specie ittiche di acquacoltura. La tecnologia è altamente efficiente e può essere implementata nella maggior parte delle condizioni di laboratorio. Riduce la necessità di ulteriori prove per preparare sospensioni monocellulari per le specie ittiche di acquacoltura.
Inizia sciacquando il pesce tilapia del Nilo di sei mesi in acqua sterile ben aerata per 15 minuti per lavare via i batteri legati liberamente dalla superficie. Per preparare il reagente di dissociazione cellulare enzimatica, diluire la collagenasi dispasi in PBS ad una concentrazione finale di un milligrammo per millilitro. Mescolare il 95% del volume della soluzione enzimatica preparata e il 5% del volume di FBS.
Quindi pre-raffreddare la centrifuga a quattro gradi Celsius prima dell'uso. Per la dissezione dei tessuti, posizionare il pesce eutanasia sul ghiaccio e raccogliere da tre a quattro centimetri della sezione centrale dell'intestino. Eliminare il grasso e il mesentere usando una pinza.
Rimuovere il grasso attaccato alla superficie intestinale e la mucosa chiara elastica e malleabile. Risciacquare delicatamente il frammento di intestino con PBS ghiacciato sterile usando una siringa per lavare via il contenuto intestinale e il muco. Dopo diversi lavaggi, sezionare il frammento in piccoli pezzi e trasferirli in un tubo da 1,5 millilitri contenente un millilitro di PBS ghiacciato.
Centrifugare la miscela a 300 x g in quattro gradi Celsius per cinque minuti. E sostituire il surnatante con un millilitro di ghiaccio freddo 0,08% BSA-DPBS. Utilizzando una pipetta di vetro aspirare delicatamente per risospendere i frammenti di tessuto.
Dopo aver lavato i pezzi ancora una volta, rimuovere il surnatante e aggiungere un millilitro del reagente di dissociazione enzimatica preparato. Mescolare anche cinque microlitri di inibitore dell'RNA con il reagente di dissociazione per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula. Posizionare il tubo a 37 gradi Celsius a bagnomaria temperato e capovolgere manualmente il tubo ogni cinque minuti durante il tempo di incubazione da 30 a 60 minuti.
Una volta che i tubi sono stati ruotati, rimuovere il reagente di dissociazione cellulare enzimatica utilizzando punte a foro largo. Aggiungere un millilitro di ghiaccio freddo 0,08% BSA-DPBS e pipettare delicatamente le cellule su e giù per prevenire la rottura cellulare. Dopo la centratura e la risospensione delle celle ancora una volta, posizionare il filtro cellulare da 40 micrometri pre-bagnato con 0,08% BSA-DPBS su un tubo conico da 50 millilitri.
Passare la sospensione cellulare attraverso il filtro. Picchiettare il colino, quindi sciacquarlo con 200 microlitri DPBS e raccogliere la sospensione sul fondo del tubo. Dopo aver trasferito la sospensione in un tubo da 1,5 millilitri, aggiungere cinque microlitri di DNA e incubare la sospensione per 15 minuti a 15-20 gradi Celsius.
Una volta centrifugato, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 400 microlitri di DPBS ghiacciato senza ioni di calcio e magnesio. Quindi pipettare delicatamente su e giù con punte larghe per mescolare le cellule e ripetere questo processo ancora una volta. Per la colorazione, mescolare la sospensione cellulare in una soluzione di blu tripano allo 0,4% in un rapporto uguale e incubare per tre minuti a temperatura ambiente.
Quindi aggiungere 10 microlitri della miscela sul vetrino. Contare le cellule vitali e morte al microscopio in tre campi e calcolare la percentuale di vitalità cellulare. Sono state confrontate le efficienze di dissociazione di diversi enzimi comunemente usati.
È stato verificato che la miscela di collagenasi dispasi ha un migliore effetto di dissociazione rispetto alla collagenasi dispasi o alla tripsina da sola e a diverse altre miscele enzimatiche. L'esame microscopico ha mostrato che le cellule intestinali avevano un'elevata vitalità e si disperdevano come singole cellule. La maggior parte delle cellule erano vitali, mentre alcune erano morte a causa della membrana cellulare permeablizzata.
Prestare attenzione al tipo di PBS utilizzato. La soluzione di digestione enzimatica non può essere utilizzata con PBS privo di calcio/magnesio poiché l'enzima richiede ioni calcio/magnesio per funzionare efficacemente. La procedura facilita gli studi a livello di singola cellula nelle specie ittiche di acquacoltura fornendo un valido riferimento per lo sviluppo di protocolli di dissociazione cellulare delle specie ittiche di acquacoltura.
