透明质酸是动物模型中最丰富的细胞外基质之一。透明质酸在胚胎发育中的重要性已经得到证明。这种体外模型有助于探索神经嵴细胞如何在富含透明质酸的细胞外基质中粘附和迁移。
利用我们的技术，我们可以评估批发群体和单个细胞随时间推移的迁移和HA降解能力。此外，该技术可用于药物筛选，以找到加速或阻止HA降解的化合物。首先，用冷却的PBS以1:50的比例稀释基底膜基质，并将其放在冰上。
用10毫升稀释的基质溶液涂覆10厘米的培养板，并在室温下孵育板一小时。用两毫升PBS清洗盘子三次。为了在基质包被的平板上培养O9-1细胞，在37摄氏度的水浴中加热完整的胚胎干细胞或ES细胞培养基。
轻轻混合O9-1细胞悬液，并使用自动细胞计数器计数细胞数量。然后用完整的ES细胞培养基将细胞浓度调节至每毫升110万个细胞。将8毫升预热的完整ES细胞培养基加入包被的10厘米培养板的基质中，并以每板110万个细胞接种O9-1细胞。
在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳加湿培养箱中孵育。第二天，用预热至37摄氏度的新鲜完全ES细胞培养基更换培养基。此后每两到三天更换一次新鲜培养基。
用两毫升PBS洗涤培养板，然后加入两毫升预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA。在 37 摄氏度下孵育五分钟。向培养板中加入两毫升预热的完整ES细胞培养基，并将解离的细胞转移到15毫升锥形管中。
将管以300g离心五分钟，并在不干扰细胞沉淀的情况下弃去上清液。向管中加入两毫升预热的完整ES细胞培养基，并通过移液彻底重悬细胞。然后将细胞接种到新培养板上，以所需的细胞密度。
小心地将 50 微升未稀释的三乙氧基硅烷加入 3.5 厘米的玻璃底培养皿中，并在室温避光下孵育五分钟。用两毫升蒸馏水清洗盘子三次，每道菜加入50微升在PBS中稀释100倍的0.25%戊二醛。在室温下孵育30分钟，然后用两毫升PBS洗涤四次，并在室温下用300微升一型胶原蛋白在0.2正常乙酸中涂覆培养皿一小时。
再次，用两毫升PBS洗涤三次。向每个培养皿中加入300微升每毫升200微克荧光素，标记透明质酸钠H2，并在室温下孵育过夜。用两毫升PBS再次洗涤三次。
干燥涂层玻璃底培养皿后，将两个孔培养插入物连接到培养皿上，并在外部填充一毫升PBS的插入物。将O9-1细胞接种到孔中，在100微升DMEM中以10， 000个细胞，每次插入含有2%胎牛血清或FBS。在5%二氧化碳加湿培养箱中以37摄氏度培养细胞培养两天，使用多合一荧光显微镜捕获相衬图像作为起点。
用镊子小心地从涂层玻璃底培养皿中取出插入物，并用两毫升PBS轻轻清洗涂层玻璃底培养皿，以去除细胞和细胞碎片。将两毫升含有2%FBS的新鲜DMEM加入培养皿中。在37摄氏度和5%二氧化碳下再培养细胞48小时，并在培养24小时和48小时后捕获相差图像。
用PBS清洗餐具，并在48小时后用一毫升4%多聚甲醛在室温下或在4摄氏度下过夜15分钟。然后用一毫升新鲜PBS洗碗三次，每次五分钟。最后，将盖玻片与安装介质一起放置，以进行进一步的形态观察。
图中显示了Tmem2标志胚胎在E9.0处的神经管的横向切片。神经管的颅骨和躯干水平的切片被双重标记为Tmem2旗蛋白和透明质酸。在神经板和神经管的边界区域观察到Tmem2表达，而这些位点没有透明质酸染色。
此处显示了Tmem2标志和Sox9的神经嵴细胞的双重标记。对E9.0神经管的横切片进行Tmem2标志和Sox9染色。该图显示了在常规培养皿上培养的Tmem2耗尽和对照O9-1细胞的代表性图像。
通过qPCR评估Tmem2在这些细胞中的表达，GAPDH作为标准化的内部对照。将Tmem2耗尽和对照O9-1细胞在涂有荧光透明质酸的玻璃盖玻片上培养48小时。透明质酸降解活性在荧光背景中显示为暗区。
还定量比较了Tmem2耗尽细胞和对照O9-1细胞之间的透明质酸降解水平。底物结合的透明质酸在O9-1细胞中粘附处的降解如图所示。在由Col1 / HA组成的混合底物上培养的O9-1细胞用抗粘着蛋白抗体进行免疫标记。
黑点或条纹代表FAHA H2底物中的透明质酸降解活性。透明质酸降解和粘连的位点在混合底物上共定位。用HA涂覆玻璃底培养皿的Coval是该方案中的关键步骤，因为涂层不足会导致HA在粘附和迁移过程中容易被机械力去除。
为了确保适当的涂层，我们使用戊二醛，化学固定化的一型胶原蛋白通过与醛的武装偶联到玻璃上。可以在第一型胶原蛋白旁边使用细胞外基质底物，但它们必须具有武装基团，并且由于其化学性质，将它们涂覆在玻璃底培养皿上可能存在局限性。因此，可能需要反复试验来确定最佳方法。
该实验室实验有助于研究某些分子在神经嵴细胞进入神经管周围的HA或HA环境的过程中如何工作。它也可能是测试药物的有用方法，可以加速或阻止这种迁移过程。有趣的是，为什么Tmem2既具有对HA的粘附功能，又具有HA降解的功能，以及为什么HA需要在全内聚位点降解。
由于HA是细胞外基质中最常见的物质，因此找出这个问题的答案在生物学和医学中非常重要。该实验方案很有价值，因为它可以应用于各种细胞类型，包括皮肤成纤维细胞、上皮细胞和癌细胞。
