ヒアルロン酸は、動物モデルにおいて最も豊富な細胞外マトリックスの1つです。胚発生におけるヒアルロン酸の重要性が実証されています。このin vitroモデルは、神経堤細胞がヒアルロン酸に富む細胞外マトリックス内でどのように接着および移動するかを調べるのに役立ちます。
私たちの技術では、卸売集団と個々の細胞の両方の移動とHA分解能力を経時的に評価できます。さらに、この技術は、HA分解を加速または防止する化合物を見つけるための薬物スクリーニングに使用できます。まず、基底膜マトリックスを冷やしたPBSで1:50の比率で希釈し、氷上に置きます。
10センチメートルの培養プレートに10ミリリットルの希釈マトリックス溶液をコーティングし、プレートを室温で1時間インキュベートします。プレートを2ミリリットルのPBSで3回洗浄します。マトリックスコーティングプラテム上でO9-1細胞を培養するには、完全な胚性幹またはES細胞培地を摂氏37度のウォーターバスで温めます。
O9-1細胞懸濁液を穏やかに混合し、自動セルカウンターを使用して細胞数をカウントします。次に、完全なES細胞培地で細胞濃度をミリリットルあたり110万細胞に調整します。マトリックスコーティングされた10センチメートルの培養プレートに8ミリリットルの予熱した完全ES細胞培地を加え、プレートあたり110万細胞でO9-1細胞を播種します。
5%二酸化炭素加湿インキュベーターで摂氏37度でインキュベートします。翌日、培地を摂氏37度に予熱した新鮮な完全ES細胞培地と交換します。その後、2〜3日ごとに新しい培地と交換してください。
培養プレートを2ミリリットルのPBSで洗浄し、2ミリリットルの予熱した0.25%トリプシン-EDTAを加えます。摂氏37度で5分間インキュベートします。2ミリリットルの予熱した完全ES細胞培地を培養プレートに加え、解離した細胞を15ミリリットルのコニカルチューブに移します。
チューブを300gで5分間遠心分離し、細胞ペレットを乱すことなく上清を廃棄します。2ミリリットルの予熱した完全ES細胞培地をチューブに加え、ピペッティングによって細胞を完全に再懸濁します。次に、細胞を新しい培養プレート上に所望の細胞密度で播種する。
50マイクロリットルの未希釈のトリエトキシシランを3.5センチメートルのガラス底皿に注意深く加え、光から保護された室温で5分間インキュベートします。皿を2ミリリットルの蒸留水で3回洗い、皿あたりPBSで100倍に希釈した50マイクロリットルの0.25%グルタルアルデヒドを加えます。室温で30分間インキュベートした後、2ミリリットルのPBSで4回洗浄し、室温で0.2ノルマル酢酸中の300マイクロリットルのコラーゲンタイプ1で皿を1時間コーティングします。
繰り返しますが、2ミリリットルのPBSで3回洗浄します。フルオレセインアミン1ミリリットルあたり200マイクログラムの300マイクロリットル、標識ヒアルロン酸ナトリウムH2を各皿に加え、室温で一晩インキュベートします。2ミリリットルのPBSで3回再度洗浄します。
コーティングされたガラス底部皿を乾燥させた後、2つのウェル培養インサートを皿に取り付け、インサートに1ミリリットルのPBSを外部から充填します。O9-1細胞を、インサートあたり2%ウシ胎児血清またはFBSを含む100マイクロリットルのDMEM中の10, 000セルのウェルに播種します。5%二酸化炭素加湿インキュベーター内で細胞を摂氏37度で2日間培養し、オールインワン蛍光顕微鏡を使用して開始時点として位相差画像をキャプチャします。
ピンセットでコーティングされたガラス底皿からインサートを注意深く取り外し、コーティングされたガラス底皿を2ミリリットルのPBSで静かに洗って、細胞と細胞の破片を取り除きます。2%FBSを含む2ミリリットルの新鮮なDMEMを培養皿に加えます。細胞を摂氏37度と5%の二酸化炭素でさらに48時間培養し、培養24時間後と48時間後に位相差画像をキャプチャします。
皿をPBSで洗浄し、48時間後に1ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドで室温で15分間、または摂氏4度で一晩細胞を固定します。次に、1ミリリットルの新鮮なPBSで皿をそれぞれ5分間3回洗います。最後に、さらに形態学的観察のために、封入剤と一緒にカバースリップを置きます。
E9.0のTmem2フラグ胚の神経管の横断面をこの図に示します。神経管の頭蓋および体幹レベルの切片は、Tmem2フラグタンパク質およびヒアルロン酸について二重標識された。Tmem2の発現は神経板と神経管の境界領域で観察されましたが、これらの部位にはヒアルロン酸染色がありませんでした。
Tmem2フラグとSox9に対する神経堤細胞の二重標識がここに示されている。E9.0神経管の横断切片をTmem2フラグおよびSox9について染色した。通常の培養皿で培養したTmem2枯渇およびコントロールO9-1細胞の代表的な画像をこの図に示します。
これらの細胞におけるTmem2の発現を、正常化のための内部コントロールとしてGAPDHを用いたqPCRによって評価した。Tmem2枯渇およびコントロールO9-1細胞を、蛍光化ヒアルロン酸でコーティングしたガラスカバースリップ上で48時間培養した。ヒアルロン酸分解活性は蛍光バックグラウンドの暗い領域として明らかにされる。
ヒアルロン酸分解のレベルも、Tmem2枯渇細胞と対照O9-1細胞の間で定量的に比較されました。O9-1細胞の局所接着における基質結合ヒアルロン酸の分解をこの図に示します。Col1/HAからなる混合基質上で培養したO9-1細胞を抗ビンキュリン抗体で免疫標識した。
ダークスポットまたはストリークは、FAHA H2基質におけるヒアルロン酸分解活性を表す。ヒアルロン酸分解部位と局所接着部位は、混合基質上に共局在していた。ガラス底皿をHAでコバールコーティングすることは、コーティングが不十分な場合、接着および移行中に機械的な力によってHAが容易に除去される可能性があるため、プロトコルの重要なステップです。
適切なコーティングを確実にするために、アルデヒドへのアーミングカップリングを介してガラスに化学的に固定化されたタイプ1コラーゲンであるグルタルアルデヒドを使用します。1型コラーゲンの他に細胞外マトリックス基質を使用することは可能ですが、それらは武装基を持っている必要があり、それらの化学的性質のためにガラス底皿にそれらをコーティングするコバールには制限があるかもしれません。したがって、最良のアプローチを決定するには、試行錯誤が必要になる場合があります。
この実験室での実験は、神経堤細胞が神経管の周りのHAまたはHA環境に移動する際に特定の分子がどのように機能するかを研究するのに役立ちます。また、この移行プロセスを加速または防止できる薬物をテストするための有用な方法でもあります。Tmem2がHAに対する接着機能とHAの劣化の両方の機能を持っている理由と、HAを完全な凝集部位で分解する必要がある理由を知ることは興味深いことです。
HAは細胞外マトリックスで最も一般的な物質であるため、この質問に対する答えを見つけることは生物学と医学において非常に重要です。この実験プロトコルは、皮膚線維芽細胞、上皮細胞、癌細胞など、さまざまな種類の細胞に適用できるため、価値があります。
