根癌农杆菌介导的窄叶车前草遗传转化

车前子物种可作为植物维管生物学和胁迫生理学的模式植物。转化方案的建立使得对这些植物的深入研究能够探索基因与其相关表型之间的关系。该技术的主要优点是它使用食物作为外植体，以高效率转化窄叶车前草。

首先，将市售的野生型车前草种子放入50毫升离心管中，最高可达5毫升标记，具体取决于所需的植物数量。将种子浸泡在75%乙醇中60秒。丢弃乙醇后，轻轻倒置试管，将种子浸入新鲜制备的20%次氯酸钠中40分钟。

在层压流动罩下，丢弃次氯酸钠溶液，然后用蒸馏水洗涤种子五次。最后一次冲洗后，在种子中加入少量水，因为这有助于植物移动到盘子上。使用无菌镊子，将种子均匀地散布在板表面，每个种子之间约1厘米，将种子转移到带有固体MS培养基的预先准备好的培养皿上，以防止发芽幼苗过度拥挤。

用两层石蜡膜密封板以防止污染，并在室温下在冷白色生长灯下孵育。一旦幼苗发芽并且足够大，通常在发芽两到三天后，使用无菌镊子将幼苗转移到装有 50 至 100 毫升 MS 培养基的无菌盒中。用手术胶带密封盒子，让植物在凉爽的白色生长灯下生长约三到四周。

将含有所需质粒的根癌农杆菌划线到具有适当选择剂的制备的固体LB板上。将石蜡密封板在 28 摄氏度下孵育长达 48 小时，或直到细菌长到足以采摘。孵育后，在转化前两天使用移液器吸头挑选细菌菌落，并将其接种在含有6毫升液体LB的15毫升圆底管中，并带有适当的选择剂。

在 28 摄氏度的台式摇床中以 200 RPM 摇晃过夜，直到 OD 600 达到 0.6 至 0.7。一旦细菌达到所需的OD，将200微升细菌培养物转移到含有100毫升LB的无菌烧瓶中。在 200 摄氏度下以 28 rpm 摇匀过夜。

然后将细菌培养物转移到50毫升无菌离心管中，并在室温下以2， 200G离心10分钟以收集细菌。弃去上清液，并通过移液在室温下将细菌沉淀重悬于5毫升新鲜制备的悬浮溶液或SS中。然后加入更多的SS至50毫升标记，并倒置以混合几次。

一旦植物达到理想的转化阶段，在大约三周内，使用无菌镊子和剪刀将根与植物分离并丢弃叶子和茎材料。切割后，立即使用镊子将根片无菌转移到装有无菌水的盒子中，以保持水分。接下来，将SS悬浮的根癌农杆菌细菌培养物倒入无菌的150 x 15毫米一次性培养皿中。

将切好的根转移到细菌培养物中并孵育至少20分钟。在孵育过程中，使用带有锋利刀片的无菌手术刀将根切成一厘米的碎片，将主根与侧根分开。然后在根部表面做薄的浅切口，让细菌感染植物。

孵育后，将根片转移到无菌纸巾上以去除多余的细菌。然后将干燥的根转移到准备好的培养皿中，该培养皿含有固体共培养基，每个板约10至20根，具体取决于根的大小。用两层透明塑料薄膜密封板，然后用铝箔在室温下孵育三天。

孵育三天后。在共培养基中，将根块转移到准备好的培养皿中，用固体芽诱导培养基或SIM卡（每升500毫克temetin）和适当的抗生素选择。将透明塑料薄膜密封板在生长灯下孵育一个月或直到芽开始出现。

一旦小苗长到1.5至2.0厘米长。将它们转移到准备好的无菌盒中。使用实根感应介质。

在生长灯下种植植物数周，直到根形成。通常，一周后，当根系变得足够大以转移时，通常在生长一个月后，将植物带上并用水轻轻清洗根部，以去除粘附在根部的任何介质。然后将植物转移到装有预润湿通用土壤BM seven的3.5英寸方形花盆中，用塑料盆盖覆盖植物，然后用透明塑料袋覆盖植物，以确保植物保持在潮湿的环境中。

该方法在根叶和小旧组织上进行了测试。在初步实验中，虽然在所有组织类型中都可以诱导老茧，但只有根组织在SIM中一个月后产生芽首字母，叶子和踏板变成棕色并死亡。从第一天开始观察从转化组织中出现的芽首字母的进展。

根部放在SIM卡上，当芽准备生根时。一周后，根组织在芽首字母开始时形成老茧。芽在第二周和第三周继续出现，四周后，芽准备转移到根诱导培养基中。

使用β-葡糖醛酸酶GUS组织化学测定法对惩罚性转基因植物进行鉴定，使用枝条长约0.5厘米后采集的叶段。具有空载体的变换中的野生类型没有染色模式。由于缺乏GUS基因，与β-葡糖醛酸酶GUS基因的转化在静脉中显示出清晰的蓝色染色模式，确认植物是转基因的根应始终保持水分，以防止在过程中干燥，一次转移大约10根根以防止这种情况。