يمكن استخدام أنواع لسان الحمل كنباتات نموذجية لبيولوجيا الأوعية الدموية النباتية وفسيولوجيا الإجهاد. يتيح إنشاء بروتوكول التحول إجراء دراسات متعمقة على هذه النباتات لاستكشاف العلاقات بين الجينات والنمط الظاهري المرتبط بها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تستخدم الأطعمة كنباتات لتحويل الموز ضيق الأوراق بكفاءة عالية.
للبدء ، ضع بذور Plantago lanceolata البرية المتاحة تجاريا في أنبوب طرد مركزي سعة 50 ملليلتر حتى علامة 5 ملليلتر ، اعتمادا على عدد النباتات المطلوبة. اغمر البذور في 75٪ إيثانول لمدة 60 ثانية. بعد التخلص من الإيثانول ، اغمر البذور في هيبوكلوريت الصوديوم الطازج بنسبة 20٪ لمدة 40 دقيقة عن طريق قلب الأنبوب برفق.
تحت غطاء تدفق صفح ، تخلص من محلول هيبوكلوريت الصوديوم ، ثم اغسل البذور خمس مرات بالماء المقطر. أضف كمية صغيرة من الماء إلى البذور بعد الشطف النهائي ، حيث يمكن أن يساعد ذلك في حركة النباتات على الألواح. باستخدام ملقط معقم ، انقل البذور إلى طبق بتري معد مسبقا مع وسط MS صلب عن طريق نشر البذور بالتساوي على سطح اللوحة ، حوالي 1 سم بين كل بذرة لمنع اكتظاظ الشتلات النابتة.
ختم لوحة مع طبقتين من فيلم البارافين لمنع التلوث واحتضان تحت ضوء أبيض بارد ينمو في درجة حرارة الغرفة. بمجرد أن تنبت الشتلات وتصبح كبيرة بما يكفي لنقلها ، عادة بعد يومين أو ثلاثة أيام من الإنبات ، استخدم ملقط معقم وانقل الشتلات إلى صناديق معقمة تحتوي على 50 إلى 100 ملليلتر من MS Medium. أغلق الصناديق بشريط جراحي ، واترك النباتات تنمو تحت ضوء النمو الأبيض البارد لمدة ثلاثة إلى أربعة أسابيع.
خط Agrobacterium tumefaciens يحتوي على البلازميد المطلوب على لوحة LB صلبة محضرة مع عامل الاختيار المناسب. احتضن صفيحة البارافين المختومة عند 28 درجة مئوية لمدة تصل إلى 48 ساعة ، أو حتى تنمو البكتيريا بشكل كبير بما يكفي للقطف. بعد الحضانة ، اختر مستعمرة بكتيريا باستخدام طرف ماصة قبل يومين من التحول ، وقم بتلقيحها في أنبوب قاعي دائري سعة 15 ملليلتر يحتوي على ستة ملليلتر من السائل LB مع عامل الاختيار المناسب.
اهتز عند 200 دورة في الدقيقة في شاكر منضدية 28 درجة مئوية ، بين عشية وضحاها ، حتى يصل OD 600 إلى 0.6 إلى 0.7. بمجرد وصول البكتيريا إلى OD المطلوب ، قم بنقل 200 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية إلى قارورة معقمة تحتوي على 100 ملليلتر من LB مع عامل الاختيار. يهز عند 200 دورة في الدقيقة عند 28 درجة مئوية ، بين عشية وضحاها.
ثم نقل الثقافة البكتيرية إلى أنابيب الطرد المركزي المعقمة 50 ملليلتر ، وأجهزة الطرد المركزي في 2 ، 200G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لجمع البكتيريا. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات البكتيرية في خمسة ملليلتر من محلول التعليق الطازج أو SS في درجة حرارة الغرفة عن طريق الماصة. ثم أضف المزيد من SS حتى علامة 50 ملليلتر واقلبها للخلط عدة مرات.
بمجرد أن تصل النباتات إلى المرحلة المثالية للتحول ، في غضون ثلاثة أسابيع تقريبا ، استخدم ملقط ومقص معقم لفصل الجذور عن النبات والتخلص من الأوراق والمواد الجذعية. مباشرة بعد القطع ، انقل قطع الجذر بشكل معقم إلى صناديق تحتوي على ماء معقم باستخدام ملقط للحفاظ على رطوبتها. بعد ذلك ، صب الثقافة البكتيرية Agrobacterium tumefaciens المعلقة SS في أطباق بتري معقمة 150 × 15 ملم يمكن التخلص منها.
نقل الجذور المقطوعة إلى الثقافة البكتيرية واحتضانها لمدة 20 دقيقة على الأقل. أثناء الحضانة ، استخدم مشرطا معقما بشفرة حادة لقطع الجذور إلى شظايا سنتيمتر واحد تفصل الجذور الأولية عن الجذور الجانبية. ثم قم بعمل جروح ضحلة رقيقة على سطح الجذور للسماح للبكتيريا بإصابة النبات.
بعد الحضانة ، انقل قطع الجذر إلى مناشف ورقية معقمة لإزالة البكتيريا الزائدة. ثم انقل الجذور المجففة إلى أطباق بتري المحضرة التي تحتوي على وسائط استزراع مشترك صلبة حوالي 10 إلى 20 جذورا لكل طبق حسب حجم الجذور. أغلق الألواح بطبقتين من الفيلم البلاستيكي الشفاف ثم بورق الألمنيوم لاحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاثة أيام.
بعد ثلاثة أيام من الحضانة. في وسائط الاستزراع المشترك ، انقل قطع الجذر إلى أطباق بتري المحضرة باستخدام وسائط تحريض إطلاق النار الصلبة أو بطاقة SIM مع 500 ملليغرام لكل لتر من التيميتين واختيار المضادات الحيوية المناسبة. احتضان الألواح البلاستيكية الشفافة المختومة تحت ضوء النمو لمدة شهر واحد أو حتى تبدأ البراعم في الظهور.
بمجرد أن تنمو النباتات بطول 1.5 إلى 2.0 سم. نقلها إلى صناديق معقمة المعدة. مع وسائط تحريض الجذر الصلبة.
تنمو النباتات تحت ضوء النمو لعدة أسابيع حتى تتشكل الجذور. عادة ، بعد أسبوع واحد ، عندما تصبح أنظمة الجذر كبيرة بما يكفي لنقلها عادة بعد شهر واحد من النمو ، خذ النبات واغسل الجذور برفق بالماء لإزالة أي وسط يلتصق بالجذور. ثم انقل النباتات إلى أواني مربعة مقاس 3.5 بوصة تحتوي على تربة مبللة مسبقا لجميع الأغراض ، وقم بتغطية النباتات بغطاء تأصيص بلاستيكي ثم بكيس بلاستيكي شفاف لضمان بقاء النباتات في بيئة رطبة.
تم اختبار هذه الطريقة على ورقة الجذر والأنسجة القديمة الصغيرة. في التجربة الأولية ، على الرغم من أنه يمكن إحداث القسوة في جميع أنواع الأنسجة ، إلا أن أنسجة الجذر فقط أنتجت الأحرف الأولى من اللقطة بعد شهر واحد في SIM ، وتحولت الورقة والدواسة إلى اللون البني وماتت. لوحظ تطور الأحرف الأولى من البراعم الخارجة من الأنسجة المحولة منذ اليوم الأول.
تم وضع الجذور على بطاقة SIM عندما تكون البراعم جاهزة للتجذير. بعد أسبوع واحد ، شكلت أنسجة الجذر قاسية في بدايات الأحرف الأولى من تبادل لاطلاق النار. استمرت البراعم في الظهور خلال الأسبوعين الثاني والثالث وبعد أربعة أسابيع ، كانت البراعم جاهزة للانتقال إلى وسط تحريض الجذر.
تم تحديد النباتات المحورة وراثيا العقابية باستخدام مقايسة بيتا جلوكورونيداز GUS النسيجية الكيميائية باستخدام شرائح الأوراق المأخوذة بمجرد أن يبلغ طول البراعم حوالي 0.5 سم. النوع البري في التحول مع المتجهات الفارغة لا يظهر أي نمط تلطيخ. نظرا لغياب جين GUS ، أظهر التحول باستخدام جين بيتا جلوكورونيداز GUS نمطا تلطيخا أزرق واضحا في الأوردة يؤكد أن النباتات معدلة وراثيا يجب دائما الحفاظ على الجذور رطبة لمنع الجفاف أثناء الإجراء نقل الجذور حوالي 10 في كل مرة لمنع ذلك.
