Las especies de Plantago se pueden utilizar como plantas modelo para la biología vascular de las plantas y la fisiología del estrés. El establecimiento de un protocolo de transformación permite realizar estudios en profundidad sobre estas plantas para explorar las relaciones entre los genes y su fenotipo asociado. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza alimentos como explantes para transformar el plátano de hoja estrecha con alta eficiencia.
Para comenzar, coloque las semillas de Plantago lanceolata de tipo silvestre disponibles comercialmente en un tubo de centrífuga de 50 mililitros hasta la marca de 5 mililitros, dependiendo de la cantidad de plantas deseadas. Sumerja las semillas en etanol al 75% durante 60 segundos. Después de desechar el etanol, sumerja las semillas en hipoclorito de sodio al 20% recién preparado durante 40 minutos invirtiendo suavemente el tubo.
Bajo una campana de flujo laminado, deseche la solución de hipoclorito de sodio, luego lave las semillas cinco veces con agua destilada. Agregue un pequeño volumen de agua a las semillas después del enjuague final, ya que esto puede ayudar al movimiento de las plantas en los platos. Usando pinzas estériles, transfiera las semillas a una placa de Petri preparada previamente con medio sólido MS extendiendo las semillas uniformemente a través de la superficie de la placa, aproximadamente 1 centímetro entre cada semilla para evitar el hacinamiento de las plántulas en germinación.
Selle la placa con dos capas de película de parafina para evitar la contaminación e incube bajo una luz de crecimiento blanca fría a temperatura ambiente. Una vez que las plántulas germinan y son lo suficientemente grandes como para transferirlas, generalmente después de dos o tres días de germinación, use pinzas estériles y transfiera las plántulas a cajas estériles que contengan de 50 a 100 mililitros de MS Medium. Selle las cajas con cinta quirúrgica y permita que las plantas crezcan bajo la luz blanca fría durante aproximadamente tres o cuatro semanas.
Rayar Agrobacterium tumefaciens que contiene el plásmido deseado en una placa LB sólida preparada con el agente de selección apropiado. Incube la placa sellada con parafina a 28 grados centígrados durante un máximo de 48 horas, o hasta que la bacteria crezca lo suficiente como para recogerla. Después de la incubación, elija una colonia de bacterias usando una punta de pipeta dos días antes de la transformación e indíquela en un tubo inferior redondo de 15 mililitros que contenga seis mililitros de LB líquido con el agente de selección apropiado.
Agite a 200 RPM en una agitadora de mesa de 28 grados centígrados, durante la noche, hasta que el OD 600 alcance 0.6 a 0.7. Una vez que las bacterias alcancen la DO requerida, transferir 200 microlitros del cultivo bacteriano a un matraz estéril que contenga 100 mililitros de LB con el agente de selección. Agitar a 200 RPM a 28 grados centígrados, durante la noche.
Luego transfiera el cultivo bacteriano en tubos de centrífuga estériles de 50 mililitros y centrifugue a 2, 200G durante 10 minutos a temperatura ambiente para recolectar las bacterias. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet bacteriano en cinco mililitros de solución de suspensión recién preparada o SS a temperatura ambiente mediante pipeteo. Luego agregue más SS hasta la marca de 50 mililitros e invierta para mezclar varias veces.
Una vez que las plantas alcanzan la etapa ideal para la transformación, en aproximadamente tres semanas, use pinzas y tijeras estériles para separar las raíces de la planta y deseche el material de la hoja y el tallo. Inmediatamente después del corte, transfiera asépticamente las piezas de la raíz a cajas que contengan agua estéril con fórceps para mantenerlas hidratadas. A continuación, vierta el cultivo bacteriano SS suspendido de Agrobacterium tumefaciens en placas de Petri desechables estériles de 150 por 15 milímetros.
Transfiera las raíces cortadas al cultivo bacteriano e incube durante al menos 20 minutos. Durante la incubación, use un bisturí estéril con una cuchilla afilada para cortar las raíces en fragmentos de un centímetro que separan las raíces primarias de las raíces laterales. Luego haga cortes delgados y poco profundos en la superficie de las raíces para permitir que las bacterias infecten la planta.
Después de la incubación, transfiera los trozos de raíz a toallas de papel estériles para eliminar el exceso de bacterias. Luego transfiera las raíces secas a las placas de Petri preparadas que contienen medios sólidos de cocultivo alrededor de 10 a 20 raíces por placa, dependiendo del tamaño de las raíces. Selle las placas con dos capas de película plástica transparente y luego con papel de aluminio para incubar a temperatura ambiente durante tres días.
Después de tres días de incubación. En los medios de cocultivo, transfiera las piezas de raíz a placas de Petri preparadas con medios de inducción de brotes sólidos o SIM con 500 miligramos por litro de temetina y selección adecuada de antibióticos. Incube las placas selladas con película de plástico transparente bajo una luz de crecimiento durante un mes o hasta que los brotes comiencen a emerger.
Una vez que las plántulas crecen de 1.5 a 2.0 centímetros de largo. Transfiéralos a cajas estériles preparadas. Con medios de inducción radiculares sólidos.
Cultiva las plantas bajo una luz de cultivo durante varias semanas hasta que se formen raíces. Por lo general, después de una semana, cuando los sistemas de raíces se vuelven lo suficientemente grandes como para transferirse, generalmente después de un mes de crecimiento, tome la planta y lave suavemente las raíces con agua para eliminar cualquier medio que se adhiera a las raíces. Luego transfiera las plantas a macetas cuadradas de 3.5 pulgadas que contengan tierra prehumedecida para todo uso BM siete cubra las plantas con una cubierta de plástico para macetas y luego con una bolsa de plástico transparente para garantizar que las plantas permanezcan en un ambiente húmedo.
Este método se probó en la hoja de la raíz y el tejido viejo mezquino. En el experimento preliminar, aunque se pudo inducir insensibilidad en todos los tipos de tejidos, solo el tejido de la raíz produjo iniciales de brotes después de un mes en SIM, la hoja y el pedal se volvieron marrones y murieron. La progresión de las iniciales del brote que emergen del tejido transformado se observó desde el primer día.
Las raíces se colocaron en la SIM para cuando los brotes estuvieran listos para ser enraizados. Después de una semana, el tejido de la raíz formó un callo en los inicios de las iniciales del brote que se pudo observar. Los brotes continuaron emergiendo durante las semanas dos y tres y después de cuatro semanas, los brotes estaban listos para ser transferidos al medio de inducción de la raíz.
La identificación de las plantas transgénicas punitivas se realizó mediante el ensayo histoquímico beta glucuronidasa GUS utilizando los segmentos foliares tomados una vez que los brotes tenían alrededor de 0,5 centímetros de largo. El tipo comodín en transformada con vectores vacíos no muestra ningún patrón de tinción. Debido a la ausencia del gen GUS, la transformada con el gen beta glucuronidasa GUS mostró un patrón de tinción azul claro en las venas que confirma que las plantas son transgénicas Las raíces siempre deben mantenerse hidratadas para evitar que se sequen durante el procedimiento, transfiera las raíces aproximadamente 10 a la vez para evitar esto.
