Agrobacterium tumefaciens - 좁은 잎 질경이의 매개 유전자 변형

질경이 종은 식물 혈관 생물학 및 스트레스 생리학의 모델 식물로 사용될 수 있습니다. 형질전환 프로토콜의 확립은 이러한 식물에 대한 심층 연구를 통해 유전자와 관련 표현형 간의 관계를 탐색할 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 식품을 외식편으로 사용하여 좁은 잎 질경이를 고효율로 변형시킨다는 것입니다.

시작하려면 시중에서 판매되는 야생형 Plantago lanceolata 종자를 원하는 식물 수에 따라 최대 50 밀리리터 원심 분리기 튜브에 넣습니다. 씨앗을 75 % 에탄올에 60 초 동안 담그십시오. 에탄올을 버린 후 튜브를 부드럽게 뒤집어 갓 준비한 20% 차아염소산나트륨에 씨앗을 40분 동안 담그십시오.

라미네이트 흐름 후드 아래에서 차아 염소산 나트륨 용액을 버린 다음 씨앗을 증류수로 5 번 씻으십시오. 최종 헹굼 후 씨앗에 소량의 물을 추가하면 식물이 접시로 이동하는 데 도움이 될 수 있습니다. 멸균 집게를 사용하여 발아하는 묘목의 과밀을 방지하기 위해 각 종자 사이에 약 1cm 떨어진 플레이트 표면에 씨앗을 고르게 펴서 고체 MS 배지가 있는 미리 준비된 페트리 접시에 씨앗을 옮깁니다.

오염을 방지하기 위해 두 겹의 파라핀 필름으로 플레이트를 밀봉하고 실온에서 차가운 흰색 성장 빛 아래에서 배양합니다. 묘목이 발아하고 옮길 수있을만큼 커지면 일반적으로 발아 2-3 일 후에 멸균 집게를 사용하여 묘목을 50-100 밀리리터의 MS 배지가 들어있는 멸균 상자로 옮깁니다. 수술용 테이프로 상자를 밀봉하고 약 3-4주 동안 서늘한 흰색 성장 빛 아래에서 식물이 자랄 수 있도록 합니다.

원하는 플라스미드를 함유하는 Agrobacterium tumefaciens 줄무늬를 적절한 선별제와 함께 준비된 고체 LB 플레이트 상에 게재합니다. 파라핀 밀봉 플레이트를 섭씨 28도에서 최대 48시간 동안 또는 박테리아가 채집할 수 있을 만큼 커질 때까지 배양합니다. 배양 후, 형질전환 2일 전에 피펫 팁을 사용하여 박테리아 콜로니를 선택하고 적절한 선택제와 함께 6밀리리터의 액체 LB가 들어 있는 15밀리리터 둥근 바닥 튜브에 접종합니다.

OD 200이 28에서 28에 도달할 때까지 섭씨 0.6도 탁상용 셰이커에서 밤새 0.7RPM으로 흔들어줍니다. 박테리아가 필요한 OD에 도달하면 200 마이크로 리터의 박테리아 배양 물을 100 밀리리터의 LB를 함유하는 멸균 플라스크에 선택 작용제와 함께 옮깁니다. 섭씨 28도에서 200RPM으로 밤새 흔들어줍니다.

그 후 세균 배양액을 50 밀리리터 멸균 원심분리 튜브에 옮기고, 2, 200G에서 실온에서 10분 동안 원심분리하여 세균을 수집하였다. 상층액을 버리고 피펫팅을 통해 실온에서 새로 준비된 현탁액 또는 SS 5밀리리터에 박테리아 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 SS를 50밀리리터 표시까지 더 추가하고 뒤집어 여러 번 혼합합니다.

식물이 형질전환을 위한 이상적인 단계에 도달하면 약 3주 후에 멸균 집게와 가위를 사용하여 식물에서 뿌리를 분리하고 잎과 줄기 재료를 버립니다. 절단 직후, 집게를 사용하여 뿌리 조각을 멸균 된 물이 들어있는 상자에 무균 적으로 옮겨 수분을 유지합니다. 다음에, SS 현탁 아그로박테리움 투메파시엔스 박테리아 배양액을 멸균된 150 x 15 밀리미터 일회용 페트리 접시에 붓는다.

잘라낸 뿌리를 박테리아 배양액에 옮기고 최소 20분 동안 배양합니다. 부화하는 동안 날카로운 칼날이 달린 멸균 메스를 사용하여 뿌리를 1 센티미터 조각으로 자르고 1 차 뿌리와 측면 뿌리를 분리합니다. 그런 다음 박테리아가 식물을 감염시킬 수 있도록 뿌리 표면을 얇고 얕게 자릅니다.

배양 후 뿌리 조각을 멸균 종이 타월로 옮겨 과도한 박테리아를 제거합니다. 그런 다음 건조된 뿌리를 뿌리의 크기에 따라 플레이트당 약 10-20개의 뿌리가 있는 고체 공동 배양 배지를 포함하는 준비된 페트리 접시로 옮깁니다. 투명 플라스틱 필름 2층으로 플레이트를 밀봉한 다음 알루미늄 호일로 밀봉하여 실온에서 3일 동안 배양합니다.

배양 3 일 후. 공동 배양 배지에서 뿌리 조각을 고체 싹 유도 배지 또는 테메틴 리터당 500mg의 SIM과 적절한 항생제 선택으로 준비된 페트리 접시로 옮깁니다. 투명 플라스틱 필름 밀봉 판을 한 달 동안 또는 싹이 나오기 시작할 때까지 성장 조명 아래에서 배양합니다.

묘목이 1.5-2.0 센티미터 길이로 자라면 준비된 멸균 상자에 옮깁니다. 단단한 뿌리 감응작용 매체로.

뿌리가 형성 될 때까지 몇 주 동안 성장 빛 아래에서 식물을 재배하십시오. 일반적으로 일주일 후, 뿌리 시스템이 옮길 수 있을 만큼 충분히 커지면 일반적으로 성장 1개월 후 식물을 채취하여 뿌리를 물로 부드럽게 씻어 뿌리에 달라붙는 배지를 제거합니다. 그런 다음 식물을 미리 습윤 된 다목적 토양 BM 7이 들어있는 3.5 인치 정사각형 화분에 옮기고 식물을 플라스틱 화분 덮개로 덮은 다음 투명한 비닐 봉지로 덮어 식물이 습한 환경에 남아 있도록합니다.

이 방법은 뿌리 잎과 사소한 오래된 조직에서 테스트되었습니다. 예비 실험에서는 모든 조직 유형에서 굳은살을 유도할 수 있었지만 SIM에서 한 달 후에 뿌리 조직에서만 싹 이니셜을 생성했으며 잎과 페달은 갈색으로 변하여 죽었습니다. 형질전환된 조직으로부터 나오는 싹 이니셜의 진행을 첫날부터 관찰하였다.

뿌리는 싹이 뿌리를 내릴 준비가 되었을 때까지 SIM에 놓였습니다. 일주일 후, 싹의 시작 부분에 굳은살을 형성한 뿌리 조직이 이니셜을 관찰할 수 있었다. 새싹은 2주와 3주 동안 계속 나타났고 4주 후에는 새싹이 뿌리 유도 배지로 옮겨질 준비가 되었습니다.

징벌적 형질전환 식물의 동정은 새싹의 길이가 약 0.5cm가 되면 채취한 잎 세그먼트를 사용하여 베타 글루쿠로니다제 GUS 조직화학적 분석을 사용하여 수행되었습니다. 빈 벡터가 있는 변환의 야생형은 염색 패턴을 나타내지 않습니다. GUS 유전자의 부재로 인해, 베타 글루쿠로니다아제 GUS 유전자로 형질전환한 식물은 식물이 형질전환되었음을 확인시켜 주는 정맥에 선명한 파란색 염색 패턴을 보였다 뿌리는 시술 중에 건조되는 것을 방지하기 위해 항상 수분을 유지해야 하며 이를 방지하기 위해 한 번에 약 10개씩 뿌리를 옮긴다.