从豚鼠眼睛中分离视网膜色素上皮细胞

视网膜色素上皮或RPE对视网膜健康至关重要。研究孤立的RPE对于视网膜疾病至关重要。这种从豚鼠中分离RPE的方法，一种流行的近视模型，有助于解决具有挑战性的问题。

该技术的主要优点是它相对简单，并且可以产生适合生物分子研究（包括RPE分析）的高质量RPE样品。通过完美地遵循所展示的技术并观察如何操作解剖工具，人们可以通过一些练习快速掌握此过程。在人道地对豚鼠实施安乐死并摘除动物的眼睛后，立即将眼睛转移到含有无菌磷酸盐缓冲盐水或PBS的10厘米培养皿中清洗眼睛。

清洗后，将眼睛转移到新鲜的PBS溶液中。现在在解剖显微镜下工作，使用18号针在一只眼睛的巩膜上开一个初始的小开口，在角膜和巩膜之间的角膜缘边界后面约一毫米处。使用剪刀去除前段，包括角膜、虹膜、睫状体和晶状体。

然后处理剩余的后眼段，用镊子抓住并轻轻拉扯Zinn的带状体，然后将视网膜从RPE/脉络膜/巩膜复合体中分离，并剥离视网膜而不碎裂。视网膜完全移除后，将剩余的后眼杯（包括 RPE、脉络膜和巩膜）浸入含有 2 毫升组织储存试剂的 12 孔板的一个孔中，并保持浸泡五分钟。要冲洗掉储存试剂，请将眼罩转移到另一个装有四毫升PBS的孔中10秒钟，然后将其移至装有两毫升PBS的第三个孔中。

在进行最后的RPE隔离步骤之前，准备一个装满PBS的一毫升注射器，并连接一个30号针头。轻轻推动注射器柱塞以产生PBS喷射流。在显微镜下工作，首先，将PBS流对准RPE，在其上留下一个小的撕裂或孔。

然后将PBS流引导到创建的开口中，将RPE作为片材从脉络膜中分离。将RPE从脉络膜上分离后，将RPE细胞收集在无针一毫升注射器中，并将收集的样品转移到1.5毫升管中。用收集的RPE以8， 000 x g 离心管一分钟以获得RPE沉淀。

对于用于RNA分析的样品，丢弃上清液，即PBS溶液，并用RNA分离试剂盒中包含的350毫升裂解缓冲液代替。上下移液内容物 20 次，以充分混合并保持样品质量。为了长期储存和保存，将样品转移到零下80摄氏度的冰箱中。

在通过电泳评估样品质量之前，请使用 RNA 分离试剂盒并按照制造商的说明从 RPE 样品中分离和收集 RNA。在我们的研究中，收集的RPE样品显示出保存完好的RNA，其RNA完整性数或RIN大于8。每只眼睛的总RNA计数约为240纳克。

发现RPE特异性基因Rpe65的表达水平在RPE样品中明显高于脉络膜和巩膜。相比之下，RPE样品显示出所选脉络膜巩膜特异性基因α-one型的最小表达，表明分离的RPE样品中没有脉络膜和巩膜污染物。该程序最重要的步骤是顺利去除视网膜，而不会留下任何视网膜碎片。

这种RPE分离程序需要解释体外细胞培养研究，但存在一些重要差异，包括分离后浸没RPE细胞的培养基的选择。