此协议允许对鼠标 RPE 细胞进行有效的隔离和培养。健康的原鼠RPE培养是了解眼部疾病的机理的宝贵模型。融合和可行的 RPE 文化在三天内获得，可以种植数周。
该议定书已成功地用于了解与年龄早期有关的黄斑变性背后的机制，这是发达国家老年人失明的主要原因。可视化解剖步骤非常重要。细节对于协议的成功至关重要，例如，如何处理眼球，使硬皮球不被打，究竟应该在哪里进行切口，以及如何将眼杯嵌入到trypsin中，以便它们保持开放。
首先为协议准备所有必要的试剂。然后，开始清洁眼球，小心地去除所有的结缔组织，血液和肌肉，使用杜蒙五号钳子和斜剪刀，而不会在硬皮上做任何切口。定期将眼球转移到含有三毫升无 HEPES HBSS 缓冲器的新鲜菜肴中，以保持眼睛新鲜和清洁，并避免任何污染。
使用视神经作为手柄，以保持眼球，并在角膜中心用锋利的碳钢11号刀片打一个洞。用杜蒙五号剪刀在角膜上切开三个切口，确保有足够的空间去除镜片。握住视神经，用斜剪刀的底座对奥拉塞拉塔施加轻微压力，直到镜头完全出来。
保持虹膜上皮完好无损，以防止潜伏期间神经网膜和 RPE 的分离。将眼睛放在无高音速的 HBSS 缓冲区中。在37摄氏度的透明质溶液中孵化眼睛，在5%的二氧化碳加气孵化器中45分钟，将神经视网膜从RPE分离出来。
将每只眼睛放在一口新井中，每口井有1.5毫升的冷HBSS HEPES缓冲器，并在冰上孵育30分钟。洗涤后，将每只眼睛放入一个35毫米的文化菜肴与新鲜的HBSS HEPES缓冲器。用八厘米的Vannas剪刀切开角膜，直到到达奥拉塞拉塔，然后切到奥拉塞拉塔下面，去除虹膜上皮和角膜。
用弯曲的钳子握住奥拉塞拉塔，使用倾斜的微钳子，拉开神经网膜，确保 RPE 层不被切割。然后，切断视神经的内部附件。切开视神经，将每个眼杯转移到不同的12个油井板中，每口井含有1.5毫升的新鲜trypsin-EDTA。
确保眼杯保持打开，并完全淹没在试剂中。在37摄氏度下将眼杯孵化45分钟，在5%的二氧化碳孵化器中。将每个眼杯与在尝试蛋白孵化过程中分离的任何 RPE 片一起收集，并将其转移到包含每口油井 1.5 毫升 FBS 溶液的 12 个井板中。
如果 RPE 表仍保留在试穿素溶液中，请使用微管将它们转移到带 FBS 解决方案的井中。将每个眼杯由视神经按住，朝下摇动到 12 个井板中，其中含有 1.5 毫升 20% FBS 的 HBS HEPES 缓冲器，直到 RPE 板完全分离。用微管收集任何 RPE 片和 RPE 聚类，避免任何可能污染培养物的白色鳞片或胆汁，并将它们放置在 15 毫升管中。
把两只眼睛从同一只老鼠身上拉到一根管子里。然后，在室温下将 RPE 混合物在 340 x g 下离心两分钟，然后丢弃超母体。轻轻将 RPE 颗粒以 0.25% 的 trypsin-EDTA 混合物中重新注入，并在 37 摄氏度的水浴中孵育一分钟，将 RPE 片分解成单个细胞。
然后轻轻地吹笛器上下10次，避免气泡形成。加入九毫升新制备的 RPE 介质，稀释并灭活 trypsin，并在室温下以 340 x g 将混合物离心两分钟。吸气超自然，并小心地用 5% FBS 将细胞颗粒重新喷入 150 微升 RPE 介质中。
接下来，从先前准备的层膜插入的底腔中取出 PBS，并添加 700 微升 RPE 介质。从膜插入的上腔取出层蛋白，并顺便将 RPE 细胞悬架滴入并均匀地分配到腔室的中心。将膜在37摄氏度的5%二氧化碳孵化器中不受干扰地插入，至少24小时。
然后检查显微镜下的膜插入，以确保大多数 RPE 细胞连接到插入物上，汇合率至少为 50% 在头 72 小时内不要更改介质。使用此协议分离的 RPE 细胞显示了典型的 RPE 大小、形态和色素化。一周后观察到一个高度极化的RPE单层，有两个核，由紧密的交汇点连接，以及存在杏微维利和基底折叠。
RPE 单层的极化得到了 TER 值的确认，平均平方度高于 200 欧米厘米，随着时间的推移保持稳定。在 FITC 标记牛 POS 上执行的噬菌体检测中，观察到 POS 的吞没和消化，表明 RPE 细胞的功能汇合单层形成。可行的文化需要很短的解剖时间，这是通过经验实现的。
一些 RPE 细胞可能保持附着在神经网状网膜上，但如果保留几个 RPE 表，协议将不会成功。必须每次使用新鲜的透明质酶来防止此问题。这些功能性原生小鼠RPE细胞培养是研究许多眼疾中RPE病理生物学的宝贵工具。
例如，此协议使得在小鼠黄斑变性模型中研究 RPE 的病理生物学成为可能。
