猪视网膜色素上皮细胞原代培养

RPE相关疾病仍然是混合疾病的主要部分，但在原代RPE细胞的虚拟培养中没有有效的残留物，无法作为RPE相关疾病的生理和病理学研究的良好模型。在该协议中，我们提供了一种易于遵循的实验方案来培养初级IPC，可以快速恢复和维持以后的RP特征，我们相信通过使用这种方法，人们可以从无痕状态研究和保护性药物筛选中快速产生RP细胞，这可以促进RPE疾病的新治疗方法的开发。分步价值演示将使该方法更容易在想要研究RP细胞的不同实验室中复制。

开始解冻组织消化酶马拉夸德并灭菌1X PBS。通过0.22微米注射器过滤装置过滤溶液，补充2%青霉素和2%链霉素。用1X PBS清洗培养板和跨孔插入物的孔。

用移液管从孔和转孔中取出PBS，并向下室中加入一毫升新鲜的1X PBS，向上室中加入600微升每毫升10微克的层粘连蛋白溶液。将板和Transwell插入物在该螺旋培养箱中在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育过夜。之后，从上室中取出层压板溶液，并在就位之前用一毫升冷的 1X PBS 洗涤两次，用 75% 乙醇和紫外线清洁层压板流罩。

准备三个含有约25毫升75%乙醇的50毫升无菌离心管，三个含有约25毫升1X PBS的50毫升无菌离心管，以及三个含有约15毫升1X PBS的10厘米无菌细胞培养皿。将四个猪眼球浸泡在10厘米培养皿中约15毫升75%乙醇中，用一把剪刀和镊子切断所有残留的结缔组织和肌肉。要净化眼球，请依次浸泡并清洗三个装有75%乙醇的50毫升无菌离心管中的四个眼球。

然后在三个装有1X PBS的50毫升无菌离心管中依次洗涤眼球。每分钟倒置一次管子以彻底清洗眼球。将四个眼球移动到含有1X PBS的10厘米无菌细胞培养皿中。

再次修剪每个眼球的外表面，以去除视神经和小碎屑。用剪刀在角膜缘和巩膜的交叉处做一个小切口。然后去除角膜、虹膜、晶状体、玻璃体和神经视网膜。

将RPE脉络膜巩膜复合物转移到新的10厘米细胞培养皿中，并进行四次切割，将眼杯平整成四叶草的形状。通过将四个 RPE 脉络膜巩膜复合物放入新的 10 厘米培养皿中并倒入 20 毫升新鲜胰蛋白酶 EDTA 溶液以合并 RPE 脉络膜巩膜复合物，在 EDTA 溶液消化中进行旅行。将培养皿放入37摄氏度的细胞培养箱中近30分钟。

30分钟后，将培养皿从培养箱中取出，向培养皿中加入20毫升含有10%FBS的预热细胞培养基。为了中和EDTA溶液中的行程，请使用5毫升移液器通过轻轻移液数次来解离RPE细胞。将细胞悬浮液收集到15毫升离心管中，然后用FBS轻轻移液另外10毫升新鲜培养基，以洗涤培养皿上的RPE脉络膜巩膜复合物。

通过在室温下以300G离心管5分钟来收集RPE细胞。使用移液管吸出超级剂，并用FBS再加入5毫升培养基以重新悬浮细胞。以 300 G 离心再离心五分钟。

倒出超级试剂并用12毫升培养基重新悬浮细胞。接下来每孔接种100， 000至200， 000个细胞到12孔培养板或跨孔插入物中。每两天更换一次培养基，当细胞完全覆盖每个插入物的孔表面时，将血清浓度降低至1%。

每两天更换一次培养基，直到收获细胞。此处显示了原代猪RPE细胞在第二天，第六天和第10天的代表性图像。通过该图形图像检测原代猪RPE细胞，原代人RPE细胞，ARPE 19细胞和猪RPE脉络膜组织中特征基因的mRNA水平的QRTPCR分析。

在这里，GAP DH被用作RTPCR的管家基因。原代猪RPE细胞使用4个生物学重复，RPE 19细胞使用3个生物学重复，其中3个生物重复用于原代人RPE细胞和猪RPE脉络膜组织。将ARPE 19细胞中的基因表达水平设置为对照。

ARPE 19和猪RPE细胞以及原代人RPE细胞和猪RPE脉络膜组织中RPE 65蛋白的西方血液分析如图所示。长春斑素在这里用作加载控制。该图显示了在含有1%FBS的DMEM基本培养基中猪RPE细胞的两周培养。

用或不含层粘连蛋白培养的细胞用RPE 65，钠钾APTA，Z01和Hex染色。图中描述了用或不带层粘连蛋白培养的细胞片中的TR测量值。该图显示了原代猪RPE和ARPE 19细胞中血管内皮生长因子或VEGF和色素上皮衍生因子或PEDF的西方血液分析。

这些图像显示了培养的原代猪RPE和ARPE 19细胞的部门功能。该协议的重要部分是从RPE神经胶质复合物中溶解RP细胞。我们建议每次使用新鲜行程和溶液，并适当控制消化时间，以溶解八个RP细胞。