该协议具有重要意义，因为它显示了来自五种哺乳动物的色素上皮细胞的分离和转染，作为在各种设置中研究眼部基因治疗的最佳系统。该方法的主要优点是其灵活性，可转移性，高细胞产量，活力和转染率，由于使用了五种物种和非病毒SB100X转座子系统。这些技术已被开发用于研究靶向视网膜和虹膜色素上皮细胞的基因治疗方法，这些细胞在本方案中被分离和转染，但可用于任何眼部研究。
演示该程序的将是实验室的技术人员Gregg Sealy。对动物实施安乐死后，使用弯曲的剪刀和Colibri镊子对眼睛进行去核，然后从眼睛上清洁剩余的肌肉组织和皮肤。将眼睛收集在充满非无菌PBS的50毫升管中，并将管转移到层流罩中。
将它们浸没在碘基溶液中两分钟，然后将眼睛转移到充满无菌PBS的50毫升管中。将一只眼睛放在无菌纱布上，并牢牢地将眼睛靠近视神经。然后用11号手术刀切近虹膜的极限。
使用剪刀，在虹膜周围切割并取出前段并将其放入培养皿中，将球茎与玻璃体一起留下，直到分离出视网膜色素上皮或RPE细胞。要分离虹膜色素上皮或IPE细胞，请用细镊子取出晶状体，并小心地拉出含有IPE细胞的虹膜。将虹膜放入培养皿中，用无菌PBS清洗。
加入500微升0.25%胰蛋白酶，在37摄氏度下孵育10分钟。除去胰蛋白酶，加入500微升完整培养基，然后用扁平的、经过火抛光的巴斯德移液器精细地刮擦IPE。收集细胞悬浮液并将其放入1.5毫升管中。
使用Neubauer室计数细胞，并将每孔0.2百万个细胞接种在具有1毫升完整培养基的24孔板中。将板放入培养箱中，在37摄氏度和5%二氧化碳下培养。为了分离RPE细胞，用薄镊子从后段取出玻璃体和视网膜。
将球茎放入24孔板中，每只眼睛加入500微升0.25%胰蛋白酶，并在37摄氏度下孵育10分钟。除去胰蛋白酶，每球加入500微升完整培养基，并用弯曲的、经过火抛光的巴斯德移液管精细地刮擦RPE细胞。收集细胞悬浮液并将其放入1.5毫升管中。
使用Neubauer室计数细胞并如前所述接种细胞。将板放入培养箱中。清洁眼睛上剩余的肌肉组织和皮肤，用碘基溶液对眼睛进行消毒，并用PBS冲洗。
要分离IPE细胞，请取下晶状体并拉出虹膜，如前所述。制备两个鸢尾花后，加入一毫升完整培养基，并通过用扁平的，经过火抛光的巴斯德移液管刮擦来分离细胞，然后计数并接种细胞。将板放入培养箱中。
要分离RPE细胞，请从后段取出玻璃体和视网膜，并将球茎置于培养皿中。用一毫升完整的培养基填充灯泡。使用弯曲的、经过火抛光的巴斯德移液器，去除RPE细胞。
使用1， 000微升移液管收集灯泡内的细胞悬浮液，并将其转移到1.5毫升管中进行重悬。然后计数并接种细胞并孵育板，如前所述。清洁后，睁开眼睛，在虹膜周围切开以去除前节，然后放入培养皿中。
将球茎与玻璃体一起放置，直到分离出RPE细胞。为了分离IPE细胞，如果晶状体带有前段，请取下晶状体并使用细镊子小心地拉出含有IPE细胞的虹膜。将虹膜放入培养皿中，用无菌PBS清洗。
用10号手术刀切开睫状体。准备鸢尾花后，用两毫升0.25%胰蛋白酶在37摄氏度下孵育10分钟。除去胰蛋白酶并加入两毫升完整培养基，然后用扁平的，经过火抛光的巴斯德移液器刮擦分离细胞。
将细胞悬浮液转移到两毫升管中，并以120倍G离心细胞10分钟，弃去上清液并将细胞重悬于两毫升完全培养基中。将每孔0.32万个细胞接种在三毫升完整培养基的六孔板中。将板放入培养箱中，在37摄氏度和5%二氧化碳下培养。
为了分离RPE细胞，用镊子从后段取出玻璃体和视网膜。避免损害视网膜色素上皮。用PBS清洗灯泡。
准备双眼后，用胰蛋白酶填充大约四分之三的灯泡，并在37摄氏度下孵育25分钟，将培养皿盖放在灯泡眼的顶部。除去胰蛋白酶并加入一毫升完整培养基。使用弯曲的、经过火抛光的巴斯德移液器，去除RPE细胞。
收集球内的细胞悬浮液并将其转移到1.5毫升的管中进行重悬。将细胞以120倍G.Seed 0.32百万个细胞在三毫升完全培养基中的六孔板中离心10分钟。将板放入培养箱中，在37摄氏度和5%二氧化碳下培养。
在加湿的培养箱中以37摄氏度和5%二氧化碳培养细胞。三到四天后，上下移液以收集不粘附的细胞，并将一半体积放入另一个孔中。用完整的培养基将孔填充到一毫升。
再过三到四天后，重复细胞收集，这次将两个孔中的非粘附细胞合并为一个。向所有孔中加入培养基。观察细胞并每周更换两次培养基。
当细胞达到汇合时，切换到具有1%FBS的完整培养基。使用上述方案，IPE和RPE细胞成功从五种不同物种中分离和培养。通过RPE65的免疫荧光在原代牛IPE细胞中证实了RPE表达模式。
使用市售的细胞毒性测定试剂盒和结电穿孔对照研究细胞活力以排除电穿孔缓冲液的潜在毒性。未观察到对细胞活力的影响。来自不同物种的预培养色素上皮细胞用黄色荧光金星蛋白转染。
转染的RPE19细胞被用作阳性对照。此处显示了预培养猪RPE中转染效率的量化。新鲜分离的兔色素上皮细胞用黄色荧光蛋白Venus转染，并通过显微镜监测。
用色素上皮衍生因子转染色素上皮细胞，并通过蛋白质印迹监测蛋白质分泌。与所有物种和研究天数的转染细胞相比，转染细胞的信号更高，并且在这段时间内没有观察到蛋白质分泌的减少。至关重要的是要避免用锋利的工具刮擦细胞。
在这里，使用火抛光的巴斯德移液器，除了小老鼠的眼睛，其中必须使用圆形手术刀。色素上皮细胞可用于开发基因治疗方法和模拟病理状况，例如氧化应激损伤。这些模型也可用于测试治疗药物。
