DNA纤维分析使我们能够了解纳米材料如何在单分子水平上影响DNA。这些信息将使开发减少纳米毒性的策略成为可能。这项技术使我们能够了解DNA动力学以及当细胞或组织暴露于DNA损伤剂（外源性或内源性）时它是如何受到影响的，我们可以研究DNA复制，DNA修复和染色质动力学研究DNA复制动力学和修复机制将有助于制定提高治疗材料功效或减少纳米药物脱靶效应的策略。
我们真正想让人们知道这种技术是我们可以或一个人可以做的不同事情。一个是了解新型化疗药物如何影响细胞的健康，看看你是否可以更快或更有效地杀死它们。接下来要考虑当你添加一个药剂时，假设它是一种新的治疗剂或药剂，你想知道它是否会伤害一个人，然后再给他们。
因此，你可以把药剂给细胞或模型系统，看看它是否伤害了细胞或模型系统，如果是，伤害了多少？接下来要看一下，我们正在开发所有这些新的纳米药物，我们希望确保这些纳米药物不会伤害人或我们注射纳米药物的地方。最后一件事是有时你想知道蛋白质如何影响DNA复制，DNA修复或染色质动力学，我们可以使用这种技术来做到这一点。
这是我实验室的医学生物技术研究硕士Shirali Patel，将演示该程序。通过将培养基从75%至80%汇合的RAW 264.5巨噬细胞中取出并将其分成两半来开始纤维测定制备。保留一半用于氯碘脱氧尿苷脉冲或氯碘脱氧尿苷储备，并在另一半中加入五微升碘脱氧尿苷，制成50微摩尔作为最终浓度。
混合后，将含碘脱氧尿苷的培养基加回平板中，并将细胞放入培养箱中20分钟。将氯碘脱氧尿苷储备培养基预热至37摄氏度，并在氯碘脱氧尿苷脉冲前向该培养基中加入氯碘脱氧尿苷。20分钟后，从RAW 264.5巨噬细胞烧瓶中吸出碘脱氧尿苷培养基混合物。
用500微升PBS（pH值为7.4）轻轻洗涤细胞，并在丢弃PBS之前旋转板。在500微升培养基中用各种浓度的氧化石墨烯纳米颗粒处理细胞并孵育30分钟。孵育后，吸出处理培养基混合物，并在丢弃PBS之前轻轻旋转板，用500微升PBS轻轻洗涤细胞。
接下来，向氯碘脱氧尿苷储备培养基中加入五微升氯碘脱氧尿苷，并用氯碘脱氧尿苷储备培养基覆盖细胞。对于氯碘脱氧尿苷脉冲，将细胞置于培养箱中20分钟。PBS洗涤后，刮掉细胞三到四分钟，然后将五毫升培养基加入板中并收集细胞。
将收集的细胞在264G下离心四分钟。除去上清液并将细胞重新悬浮在一毫升冰冷的PBS中。为了制备DNA纤维，用铅笔用实验条件和日期标记载玻片。
在移液器中吸出两微升细胞，并将移液器保持在大约 45 度角。然后将移液器放在载玻片标签下方约一厘米处，并将移液器水平移向载玻片标签，缓慢释放细胞溶液。一旦溶液蒸发并看起来粘稠和粘稠，用15微升裂解缓冲液覆盖每行细胞，不要让移液器吸头接触载玻片。
然后将载玻片倾斜25度角，让DNA扩散风干至少四个小时。在第一天，通过将载玻片浸入甲醇乙酸中两分钟来固定 DNA 纤维。在第二天，将载玻片放在载玻片载体中，并在20摄氏度下孵育至少24小时。
为了使DNA变性，准备一个加湿室，并将载玻片小心地放入装有去离子水或去离子水的Coplin罐中，确保涂层表面不会接触罐壁。孵育20秒后，倒出水。将2.5摩尔盐酸加入Coplin罐中，覆盖所有载玻片。
孵育80分钟后，用PBS加0.1%吐温洗涤一次，然后在室温下用PBS洗涤两次，每次三分钟。对于免疫染色，将载玻片放入加湿室中，并在室温下使用PBS中的5%牛血清白蛋白或BSA封闭30分钟。然后用透明塑料布覆盖载玻片。
封闭后，取下盖玻片，沿载玻片长度加入100微升一抗溶液。添加新的塑料盖玻片并等待两个小时。两个小时后，敲掉抗体溶液，并在充满PBS的Coplin罐中冲洗载玻片两次。
通过在载玻片上添加 200 微升 5%BSA 再次阻塞载玻片。加入塑料盖玻片并孵育 15 分钟。取下盖玻片并使用纸巾去除多余的BSA后，沿载玻片长度加入100微升二抗溶液，并放置新的塑料盖玻片。
一小时后，取下盖玻片，在纸巾上敲掉多余的BSA，然后在PBS中清洗载玻片两次。沿载玻片长度加入100微升叔抗溶液，并放置新的塑料盖玻片。同样，沿每张载玻片加入200微升5%BSA，孵育15分钟。
用PBS洗涤三次后，去除多余的PBS，让它们完全干燥。干燥后，将安装介质添加到载玻片上，并放置玻璃盖玻片，以免形成气泡。使用配备摄像头、60 倍物镜和适当滤光片组的免疫荧光显微镜可视化免疫染色的 DNA 纤维，以检测 Alexa Fluor 488 和 594 染料。
通过比较碘脱氧尿苷和氯碘脱氧尿苷纳米颗粒暴露前后细胞的复制模式，确定长期暴露于纳米材料后复制模式的变化。DNA纤维分析和解释图像揭示了控制巨噬细胞和氧化石墨烯纳米颗粒处理的巨噬细胞DNA的模式。在复制中间体的模式中观察到这种变化，表明在同一条件的不同区域的新来源增加。
通过将载玻片的总面积划分为五到六个区域并从每个区域拍摄多个图像来获得确凿的光纤数据。从多个载玻片或条件中选择大约500种中间体是研究DNA复制动力学变化的理想选择。分析还表明，与对照组相比，仅红色轨迹的增加，表明测定和氧化石墨烯处理的细胞中新烧制的起源减少。
DNA纤维扩散的质量取决于纤维彼此之间的扩散程度以及它们不重叠的程度。一旦纤维被展开并且IdU和CldU被染色，找到DNA纤维就非常重要。在你制造DNA纤维后，你可以做的一件事是，第一，你可以看看复制动力学是如何受到影响的。
第二，你可以看看DNA损伤相对于DNA复制轨迹的位置。最后一件事是，如果你使用FISH探针，你实际上可以查看特定的区域以及它们如何受到DNA损伤的影响。这项技术为化疗药物的开发、药物设计以及了解DNA复制如何受到各种类型蛋白质的影响铺平了道路。
