DNAファイバー分析により、ナノ材料が単一分子レベルでDNAにどのように影響するかを理解することができます。そして、この情報により、ナノ毒性を低減する戦略の開発が可能になります。この技術により、DNAダイナミクスと、細胞または組織が外因性または内因性のDNA損傷剤にさらされたときにどのように影響を受けるかを理解することができ、DNA複製、DNA修復、およびクロマチンダイナミクスを調べることができますDNA複製のダイナミクスと修復メカニズムを研究することは、治療材料の有効性を改善したり、ナノメディシンのオフターゲット効果を減らしたりする戦略の開発に役立ちます。
このテクニックについて本当に知ってもらいたいのは、私たちができること、または一人でできることの違いです。1つは、新しい化学療法剤が細胞の健康にどのように影響するかを理解し、それらをより速くまたはより効率的に殺すことができるかどうかを確認することです。次のことは、あなたが薬剤を追加するとき、それが新しい治療薬または医薬品であるとしましょう、あなたが彼らにそれを与える前にそれが人を傷つけるかどうかを知りたいです。
したがって、エージェントをセルまたはモデルシステムに提供して、それがセルまたはモデルシステムを傷つけるかどうか、もしそうなら、どれだけ傷つくかを確認できますか?次に、私たちはこれらすべての新しいナノ医薬品を開発しており、それらのナノ医薬品が人やナノ医薬品を注入している場所に害を及ぼさないようにしたいと考えています。最後に、タンパク質がDNA複製、DNA修復、またはクロマチンダイナミクスにどのように影響するかを知りたい場合があり、この手法を使用してそれを行うことができます。
これは、私の研究室の医療バイオテクノロジー研究の修士課程の学生であるシラリ・パテルが手順を実演します。ファイバーアッセイの準備は、培地を75%から80%のコンフルエントなRAW 264.5マクロファージ細胞から取り出し、それを2つに分割することによって開始します。半分をクロロヨードデオキシウリジンパルスまたはクロロヨードデオキシウリジン予備用に予約し、残りの半分に5マイクロリットルのヨードデオキシウリジンを加えて、最終濃度として50マイクロモルにします。
混合後、ヨードデオキシウリジン含有培地をプレートに戻し、細胞をインキュベーターに20分間入れます。クロロヨードデオキシウリジン予備培地を摂氏37度に予熱し、クロロヨードデオキシウリジンパルスの前にこの培地にクロロヨードデオキシウリジンを追加します。20分後、ヨードデオキシウリジン培地混合物をRAW264.5マクロファージ細胞フラスコから吸引する。
細胞を500マイクロリットルのPBS(pH7.4)で穏やかに洗浄し、プレートを回転させてからPBSを廃棄します。500マイクロリットルの培地中の様々な濃度の酸化グラフェンナノ粒子で細胞を処理し、30分間インキュベートする。インキュベーション後、処理培地混合物を吸引し、PBSを廃棄する前にプレートを穏やかに回転させて細胞を500マイクロリットルのPBSで穏やかに洗浄します。
次に、クロロヨードデオキシウリジン予備培地に5マイクロリットルのクロロヨードデオキシウリジンを加え、クロロヨードデオキシウリジン予備培地で細胞を覆う。クロロヨードデオキシウリジンパルスの場合は、細胞をインキュベーターに20分間入れます。PBS洗浄後、細胞を3〜4分間こすり落とし、プレートに5ミリリットルの培地を加えて細胞を回収します。
回収した細胞を264Gで4分間遠心分離します。上清を取り除き、細胞を1ミリリットルの氷冷PBSに再懸濁します。DNAファイバーを調製するには、鉛筆を使用して、スライドガラスに実験条件と日付のラベルを付けます。
ピペットで2マイクロリットルの細胞を吸引し、ピペットを約45度の角度で保持します。次に、ピペットをスライドラベルの約1センチメートル下に置き、細胞溶液をゆっくりと放出しながら、ピペットをスライドラベルに向かって水平に動かします。溶液が蒸発し、べたつきや粘着性があるように見えたら、ピペットチップがスライドに触れないように、細胞の各ラインに15マイクロリットルの溶解バッファーを重ねます。
次に、スライドを25度の角度で傾け、DNAスプレッドを最低4時間風乾させます。1日目に、スライドをメタノール酢酸に2分間浸してDNA繊維を固定します。2日目に、スライドをスライドガラスキャリアに入れ、摂氏20度で最低24時間インキュベートします。
DNAを変性させるには、加湿チャンバーを準備し、スライドを脱イオン水(DI)を含むコプリンジャーに注意深く置き、コーティングされた表面がジャーの壁に触れないようにします。20秒間のインキュベーションの後、水を注ぎます。2.5モルの塩酸をコプリンジャーに加え、すべてのスライドを覆います。
80分間のインキュベーション後、PBSと0.1%Tweenで1回洗浄し、続いて室温でそれぞれ3分間PBSで2回洗浄します。免疫染色の場合は、スライドを加湿チャンバーに入れ、5%ウシ血清アルブミン(BSA)をPBS中で室温で30分間ブロックします。次に、スライドを透明なプラスチックシートで覆います。
ブロッキング後、カバースリップを取り外し、スライドの長さに沿って100マイクロリットルの一次抗体溶液を追加します。新しいプラスチック製のカバースリップを追加し、2時間待ちます。2時間後、抗体溶液をノックオフし、PBS充填コプリンジャーでスライドを2回すすぎます。
スライドに沿って200マイクロリットルの5%BSAを追加して、スライドを再度ブロックします。プラスチック製のカバースリップを追加し、15分間インキュベートします。カバースリップを外し、ペーパータオルで余分なBSAを取り除いた後、スライドの長さに沿って100マイクロリットルの二次抗体溶液を加え、新しいプラスチックカバースリップを置きます。
1時間後、カバースリップを取り外し、ペーパータオルで余分なBSAをノックオフし、スライドをPBSで2回洗浄します。スライドの長さに沿って100マイクロリットルの三次抗体溶液を追加し、新しいプラスチックカバースリップを置きます。繰り返しますが、各スライドに沿って200マイクロリットルの5%BSAを加え、15分間インキュベートします。
PBSで3回洗浄した後、余分なPBSを取り除き、完全に乾かします。乾いたら、スライドに封入剤を追加し、気泡を発生させずにガラスカバースリップを置きます。カメラ、60倍対物レンズ、Alexa Fluor 488および594色素を検出するための適切なフィルターセットを備えた免疫蛍光顕微鏡を使用して、免疫染色されたDNAファイバーを視覚化します。
ナノ材料への長期暴露後の複製パターンの変動は、ヨードデオキシウリジンおよびクロロヨードデオキシウリジンナノ粒子曝露前後の細胞の複製パターンを比較することによって決定された。DNAファイバーの解析と解釈画像により、コントロールマクロファージ細胞と酸化グラフェンナノ粒子処理マクロファージDNAのパターンが明らかになりました。複製中間体のパターンに変動が観察され、同じ状態の異なる領域で新しい起源の増加が示されました。
決定的なファイバーデータは、スライドの総面積を5〜6つの領域に分割し、各領域から複数の画像を撮影することによって取得されました。複数のスライドまたは条件から約500の中間体を選択することは、DNA複製ダイナミクスの変動を調べるのに理想的でした。分析はまた、赤色のみのトラックの増加を示し、対照と比較して、酸化グラフェン処理セルにおける決定および新たに発火した起源の減少を示した。
DNAファイバーの広がりの質は、ファイバーが互いにどれだけうまく広がっているか、そしてそれらが重なっていないかによって異なります。繊維を広げ、IdUとCldUを染色したら、DNA繊維を見つけることが非常に重要です。DNAファイバーを作った後にできることの1つは、複製のダイナミクスがどのように影響を受けるかを調べることです。
第二に、DNA複製トラックに対してDNA損傷がどこにあるかを見ることができます。そして最後に、FISHプローブを使用すると、特定の領域と、それらがそのDNA損傷によってどのように影響を受けるかを実際に見ることができます。この技術は、化学療法薬の開発、薬物設計、およびDNA複製がさまざまな種類のタンパク質によってどのように影響を受けるかを理解するための道を開きます。
