El análisis de fibras de ADN nos permite comprender cómo los nanomateriales afectan al ADN a nivel monomolecular. Y esta información permitirá desarrollar estrategias que reduzcan la nanotoxicidad. Esta técnica nos permite comprender la dinámica del ADN y cómo se ve afectada cuando las células o los tejidos están expuestos a agentes dañinos para el ADN, ya sean exógenos o endógenos, y podemos observar la replicación del ADN, la reparación del ADN y la dinámica de la cromatina. El estudio de la dinámica de replicación del ADN y el mecanismo de reparación ayudará a desarrollar estrategias que mejorarán la eficacia del material terapéutico o reducirán el efecto fuera del objetivo de la nanomedicina.
Lo que realmente queremos que la gente sepa sobre esta técnica es que son las diferentes cosas que podemos hacer o que una persona puede hacer. Una es comprender cómo los nuevos agentes quimioterapéuticos pueden afectar la salud de una célula, para ver si puede matarlos más rápido o de manera más eficiente. Lo siguiente es pensar en cuando está agregando un agente, digamos que es un nuevo agente terapéutico o farmacéutico, desea saber si va a lastimar a una persona antes de dárselo.
Por lo tanto, puede administrar el agente a las células o sistemas modelo y ver si daña las células o el sistema modelo, y si es así, ¿cuánto? Lo siguiente es ver, estamos desarrollando todas estas nuevas nanomedicinas y queremos asegurarnos de que esas nanomedicinas no dañen a una persona o al lugar donde estamos inyectando la nanomedicina. Lo último es que a veces quieres saber cómo una proteína afecta la replicación del ADN, la reparación del ADN o la dinámica de la cromatina y podemos usar esta técnica para poder hacerlo.
Este es Shirali Patel, un estudiante de maestría en investigación de biotecnología médica en mi laboratorio, demostrará el procedimiento. Comience la preparación del ensayo de fibra retirando el medio de 75% a 80% de células macrófagas RAW 264.5 confluentes y dividiéndolo en dos mitades. Reserve una mitad para la reserva de pulso de cloro-yododesoxiuridina o cloro-yododesoxiuridina y agregue cinco microlitros de yododesoxiuridina a la otra mitad, haciendo 50 micromoles como concentración final.
Después de mezclar, agregue el medio que contiene yododesoxiuridina a las placas y coloque las células en la incubadora durante 20 minutos. Precaliente el medio de reserva de cloroyododesoxiuridina a 37 grados centígrados y agregue cloroyododesoxiuridina a este medio antes del pulso de cloroyododesoxiuridina. Después de 20 minutos, aspirar la mezcla de medio de yododesoxiuridina del matraz de células macrófagas RAW 264.5.
Lave suavemente las células con 500 microlitros de PBS, con un pH de 7,4, y gire la placa antes de desechar el PBS. Tratar las células con diversas concentraciones de nanopartículas de óxido de grafeno en 500 microlitros del medio e incubar durante 30 minutos. Después de la incubación, aspire la mezcla del medio de tratamiento y lave suavemente las células con 500 microlitros de PBS girando suavemente la placa antes de desechar el PBS.
A continuación, agregue cinco microlitros de cloro-yododesoxiuridina al medio de reserva de cloro-yododesoxiuridina y cubra las células con el medio de reserva de cloro-yododesoxiuridina. Para el pulso de cloroyododesoxiuridina, coloque las células en la incubadora durante 20 minutos. Después de un lavado de PBS, raspe las células durante tres o cuatro minutos, luego agregue cinco mililitros de medio a la placa y recoja las células.
Centrifugar las células recogidas a 264G durante cuatro minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en un mililitro de PBS helado. Para preparar las fibras de ADN, etiquete las diapositivas de vidrio con la condición experimental y la fecha, usando un lápiz.
Aspire dos microlitros de células en una pipeta y sostenga la pipeta en un ángulo de aproximadamente 45 grados. A continuación, coloque la pipeta aproximadamente un centímetro por debajo de la etiqueta de la guía y mueva la pipeta horizontalmente hacia la etiqueta de la guía con una liberación lenta de la solución celular. Una vez que la solución se evapore y se vea pegajosa y pegajosa, superponga cada línea de celdas con 15 microlitros de tampón de lisis sin dejar que la punta de la pipeta toque el portaobjetos.
Luego incline el portaobjetos en un ángulo de 25 grados y permita que el ADN se seque al aire durante un mínimo de cuatro horas. El primer día, fije las fibras de ADN sumergiendo los portaobjetos en ácido acético de metanol durante dos minutos. El segundo día, coloque los portaobjetos en un portaportaobjetos de vidrio e incubarlos a 20 grados centígrados durante un mínimo de 24 horas.
Para desnaturalizar el ADN, prepare una cámara humidificada y coloque los portaobjetos cuidadosamente en un frasco de Coplin que contenga agua desionizada o DI, asegurándose de que las superficies recubiertas no toquen las paredes del frasco. Después de 20 segundos de incubación, vierta el agua. Agregue ácido clorhídrico molar 2.5 al frasco de Coplin, cubriendo todos los portaobjetos.
Después de 80 minutos de incubación, dé un lavado con PBS más 0.1% Tween, seguido de dos lavados con PBS durante tres minutos cada uno a temperatura ambiente. Para la inmunotinción, coloque los portaobjetos en la cámara humidificada y bloquéelos con albúmina sérica bovina al 5%, o BSA, en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego cubra las diapositivas con una lámina de plástico transparente.
Después de bloquear, retire el resbalón de la cubierta y agregue 100 microlitros de la solución de anticuerpos primarios a lo largo de la longitud del portaobjetos. Agregue una nueva cubierta de plástico y espere dos horas. Después de dos horas, retire la solución de anticuerpos y enjuague los portaobjetos en un frasco de Coplin lleno de PBS dos veces.
Bloquee las diapositivas nuevamente agregando 200 microlitros de 5% BSA a lo largo del portaobjetos. Agregue un cubreobjetos de plástico e incube durante 15 minutos. Después de quitar el cubreobjetos y eliminar el exceso de BSA con una toalla de papel, agregue 100 microlitros de la solución de anticuerpos secundarios a lo largo de la longitud del portaobjetos y coloque un nuevo cubreobjetos de plástico.
Después de una hora, retire el cubierto, retire el exceso de BSA en una toalla de papel y lave las diapositivas dos veces en PBS. Agregue 100 microlitros de la solución de anticuerpos terciarios a lo largo de la longitud del portaobjetos y coloque un nuevo cubreobjetos de plástico. Nuevamente, agregue 200 microlitros de 5% BSA a lo largo de cada portaobjetos e incube durante 15 minutos.
Después de tres lavados con PBS, retire el exceso de PBS y deje que se sequen por completo. Una vez seco, agregue el medio de montaje en la corredera y coloque los deslizamientos de la cubierta de vidrio sin permitir la formación de burbujas. Visualice las fibras de ADN inmunoteñidas utilizando un microscopio inmunofluorescente equipado con una cámara, un objetivo 60x y conjuntos de filtros apropiados para detectar colorantes Alexa Fluor 488 y 594.
La variación en los patrones de replicación después de la exposición a largo plazo a los nanomateriales se determinó comparando los patrones de replicación de las células antes y después de la exposición a nanopartículas de yododesoxiuridina y cloroyododesoxiuridina. El análisis de la fibra de ADN y las imágenes de interpretación revelaron un patrón para el control de las células de macrófagos y el ADN de macrófagos tratado con óxido de grafeno-nanopartículas. La variación se observó en el patrón de intermedios de replicación, mostrando un aumento en los nuevos orígenes en una región diferente de la misma condición.
Los datos concluyentes de fibra se obtuvieron dividiendo el área total de la diapositiva en cinco a seis regiones y tomando múltiples imágenes de cada región. La selección de alrededor de 500 productos intermedios de múltiples diapositivas o condiciones fue ideal para investigar la variación en la dinámica de replicación del ADN. El análisis también indicó un aumento en las pistas solo rojas, lo que indica determinaciones y una disminución en los orígenes recién disparados en las células tratadas con óxido de grafeno en comparación con el control.
La calidad de la propagación de la fibra de ADN depende de qué tan bien se extiendan las fibras entre sí y de que no se superpongan. Una vez que las fibras se han extendido y IdU y CldU se han teñido, es extremadamente importante encontrar las fibras de ADN. Una de las cosas que puede hacer después de hacer las fibras de ADN es, primero, puede ver cómo se ve afectada la dinámica de replicación.
Dos, puede ver dónde se encuentra el daño del ADN en relación con las pistas de replicación del ADN. Y lo último es que si usas las sondas FISH, puedes ver regiones específicas y cómo se ven afectadas por ese daño en el ADN. Esta técnica allana el camino para el desarrollo de medicamentos de quimioterapia, el diseño de fármacos y la comprensión de cómo la replicación del ADN se ve afectada por varios tipos de proteínas.
