TEM断层扫描广泛用于细胞成像，但在标本厚度方面非常有限。FIB SEM和软X射线断层扫描可用于较大的样品，尽管分辨率较低。STEM断层扫描完美地填补了这一空白。
STEM断层扫描提供了微米厚样品的视图，分辨率为几纳米。与低温制备相结合，我们可以以 3D 形式查看生物样品和切片。查看 STEM 光学器件的基础知识，以了解图像形成，并确保服务工程师已很好地对齐阀杆和 Lomax 阀杆模式，并且校准步骤与视频中的步骤相似。
首先，加载列对齐文件并打开列值。如果使用侧入式冷冻支架，请打开冷冻护罩并以 TEM 模式启动。光束应出现在屏幕上。
如果光束未显示，请降低放大倍率。按下控制面板上的按钮，使显微镜以共心聚焦。将光斑大小设置为方便的值，以便直接或使用内置摄像头可视化荧光屏。
将显微镜设置为STEM模式，并验证焦点是否使用聚光镜而不是物镜。在面板上，设置共心焦点并退出衍射模式以进行初始调整。确保光束不是空白的，并降低放大倍率，直到光束出现在屏幕上。
将光束偏移调整到中心，并以高达 70， 000 的步长增加放大倍率，同时将光束保持在中心。然后插入所需的聚光镜孔径，微探头模式通常为50微米，并检查孔径居中。在来回转动对焦旋钮时，光斑应该扩大和收缩，但保持原位，就好像飞机切割了一个假想的垂直沙漏一样。
如果光圈未居中，则照明将横向移动，就像沙漏倾斜一样。将光束聚焦，按对齐选项卡中的强度列表焦点，或返回到以心为中心。将光束位置重新调整到中心并调整旋转中心。
现在，将焦点步进轮旋转到最小值或上方一步，以便光束轻轻脉冲并确保在焦点上下移动时保持静止。选择枢轴点，并通过 X 和 Y 调整将两个点组合在一起。调整聚光镜柱头以使光束变圆。
通过焦点上下移动以进行优化。通过焦点时，不应有向一个方向或另一个方向拉长的趋势。归一化镜头，然后将放大倍率逐渐增加到约240， 000，同时使用光束偏移保持光斑居中并重复旋转中心和枢轴点调整。
返回衍射模式。在此阶段，光束应在荧光屏上显示为均匀圆盘。相机长度现在有效地控制了到探测器的光学距离，作为X射线晶体学。
更换它并观察圆盘收缩和放大，就好像屏幕位置会朝向或远离标本一样。此锥体表示明场照明。要在高放大倍率下使用STEM模式，请从明场杆检测器开始，然后调整衍射对齐，以使用所需的相机长度使光束居中。
打开屏幕上的明场标记，将相机长度减小到330，抬起屏幕并插入探测器。在显微镜软件中开始扫描。使用示波器显示屏提供帮助，同时按照手稿中所述调整亮度和对比度设置。
多次迭代调整。在高放大倍率寄存器中将显微镜返回到相对较低的放大倍率，而不进入低放大倍率模式。插入荧光屏并记下屏幕电流以供参考。
与TEM一样，电流可以通过喷枪镜头和光斑尺寸设置来改变，增加数字对应于电流的减小。此时，保存 FEG 寄存器以方便返回到标准值。转到LMTEM模式以查看标本。
插入标本。将样品带到以工心为中心的高度。有几种方法可以做到这一点。
例如，使用载物台摆动器倾斜网格，同时沿 Z 轴移动标本高度，直到图像停止横向移动。或者，在观看屏幕上标记一些特征并将舞台倾斜到 10 到 30 度。要素将横向移动。
调整试样高度以使其恢复到原始位置。增加放大倍率或载物台倾斜度以细化并将倾斜度恢复为零度。现在返回 STEM 模式并插入 STEM 检测器。
确保未选中启用 LM 扫描。转到最低高放大倍率模式。通过该方法调整聚光镜散光。
将光束放在较薄的样品区域上，聚焦在两侧样品的阴影图像之间透射光束爆炸的点上。然后调整冷凝器调谐，使中央圆盘变圆。这需要一些练习，特别是对于低温样品。
返回到 50 微米孔径并更新 FEG 寄存器。转到 LMSTEM 模式并继续扫描以查找感兴趣的区域。如有必要，此时大致重新调整探测器亮度和对比度设置。
按下正心对焦，增加放大倍率，细化对焦，同时使用显微镜提供的对焦环进行扫描，并检查金珠上的散光。到目前为止，一切都在纳米探针模式下进行。请注意，插入较小的聚光镜孔径会降低半会聚角，这对于厚样品很有帮助。
TFS 仪器的另一种方法是切换到微探头模式，这会减小半会聚角。然后，调整相机长度，以使收集角度比会聚角大三倍;即屏幕上的BF探测器区域标记大约是光束的三倍。
使用方程式估计记录的剂量。根据经验，整个断层扫描的瞄准每平方墨水 100 到 150 个电子。将载物台恢复为整体，并使用光斑尺寸和/或枪透镜设置调整光束电流，以达到所需的屏幕电流。
在 STEM 模式下记录的完整低放大倍率网格图显示了具有感兴趣单元格的区域。细胞看起来部分明亮，电子散射向HAADF探测器。在STEM模式下记录的中分辨率地图显示了两个中分辨率锚图。
茎倾斜系列的零度倾斜允许可视化线粒体的磷酸钙沉积物、嵴和金基准标记。图中显示了 60 纳米和 40 纳米厚截面的体积渲染。冷冻干细胞断层扫描（CSTET）在结构生物学和细胞生物学之间架起了一座桥梁，并为超分辨率荧光提供了背景。
无需切片或薄片准备，我们可以看到整个细胞剧院处于近乎原生的状态。
