本视频将重点介绍用于冷冻电子断层扫描的酵母沙门氏菌的制备 我们将经历从细胞培养到冷冻电子断层扫描的工作流程 酿酒酵母培养用于悬浮液中的离子标本制备 建议在无菌条件下工作 层流盒内部工作 十毫升无菌酵母提取到用于细胞培养的培养基中 加入灭菌培养瓶 一毫升无菌20%葡萄糖添加到 将带有培养基的培养基一个酵母菌落的烧瓶从我们的培养板中小心地挑选出来，并转移到培养瓶中制备的生长培养基中，然后用箔片覆盖并充分混合以分散细胞细胞培养物置于培养箱中并在三十度下不断搅拌直到达到指数相酵母细胞培养物生长到指数相，并通过测量细胞物理密度来测量细胞将仪表保持在清洁介质上作为参考样品细胞培养物浓缩到OD1或OD30，在白炽冷冻前加入5%的甘油 电镜网格表面被清洁并激活以通过等离子体网格应用细胞悬浮液 被放置在面向碳面朝上的辉光放电室中，等离子体清洁程序设置为30至45秒 EM网格现在已经为细胞做好了准备样品应用 EM 网格上酵母细胞悬浮液的玻璃化是通过使用 Vitrobot 机器将白色冷冻到液态乙烷中完成的 液体乙烷的制备是通过在用液氮冷却的金属杯中液化乙烷气体而进行的 EM 网格与细胞悬浮液通过从背面的滤纸和从前碳侧弯曲的非粘性塑料进行印迹 Vitrobot腔室内的温度设置为在Vitrobot屏幕上设置了18度和湿度到百分之百的等待时间，印迹时间和印迹力 辉光放电网格由Vitrobot镊子拾取并安装到仪器上 三点五微升酿酒酵母悬浮液施加到Vitrobot气候箱内网格的碳侧 在每次网格应用被白炽冻结之前，需要正确混合悬浮将带有玻化细胞的乙烷电镜网格放入液氮条件下储存或安装到网格盒中以加载到冷冻SEM显微镜中，然后将带有玻化细胞的网格固定到适合加载到SEM和TEM显微镜的网格盒中C夹环安装在夹刀上并在液氮网格中冷却，将碳面朝下放置在网格盒上并用夹住然后将C形夹环形样品放入专用网格盒中 用于LAMILA制备的样品被装载到双光束FIB / SEM显微镜中并与冷冻台制备室安装的装载罐适当冷却并充满液氮的样品架称为穿梭车，被放入并冷却作为网格盒的样品从存储杜瓦瓶转移到锅中，网格被放置在两个插槽中穿梭碳侧，电池面朝上，以防使用FIB网格墨盒，网格滤芯的切口应小心地对准十二点钟，穿梭网格由螺钉拧紧，穿梭机向下翻转至装载位置 装载锅放置在转运站并盖上盖子 带有装载罐的转移室放置在盖子的顶部并通过泵送 带网格的低真空穿梭机被固定在杆上并封闭在小转移室内部 收集到制备室的腔室被泵送并将梭子插入冷冻级 在高真空中 SEM室级倾斜到四十五度并在网格的中心位置移动四毫米 插入气体注入系统的针在生物样品上形成有机保护层，防止在聚焦过程中受到辐射损伤离子束研磨网格然后溅射涂上无机金属的薄面纱，在生物材料上形成导电层 聚焦离子束研磨薄片在细胞簇或单层中在几个步骤中完成 阶段被移动到铣削角度感兴趣的区域被发现并创建顶部和底部研磨图案粗糙的薄片被研磨随着FIB电流和薄片厚度的逐渐减小，薄片的最终抛光是仅以上部图案和低FIB电流进行，以避免前端损坏和片体表面的遮蔽效果电子束显示了研磨过程中的进展，在这里我们可以看到最终抛光的薄片片的最终厚度需要小于二百五十纳米才能透明以传输电子束的薄片在细胞簇和单层中铣削的薄片具有优缺点两种样品类型的网格都用拉马利非常轻柔地通过制备室转移回加载锅，锅冷却并充满新鲜干净的液氮，以避免冰污染，铣削的拉马利网格从穿梭机上取出并返回网格盒，用碾磨的拉马利最终转移到透射电子冷冻显微镜网格必须旋转九十度，然后插入TEM自动加载盒确保薄片相对于TEM倾斜访问的正确方向 拉米利被筛选和用于获取冷冻电子断层扫描数据的感兴趣区域定位 薄片主轴垂直于显微镜的倾斜轴，以在高倾斜角度下看到正确的视野 剂量学方法用于收集冷冻电子断层扫描收集数据 然后在Etomo软件中处理和单层分割在Amira中软件 在此实验方案中，我们向您展示了如何使用冷冻聚焦离子束铣削为薄片微机有效制备酵母细胞样品，以及如何制备和处理电子断层扫描数据和细胞lamali
