使用刺胞动物模式生物Clytia hemisphaerica表征体内上皮伤口愈合

该协议允许在活体动物伤口愈合期间可视化上皮细胞。它使我们能够看到细胞在其自然复杂环境中的行为。该技术将试剂引入细胞外基质和细胞质中，以研究这些试剂对活体动物伤口愈合过程中细胞扩散和迁移的影响。

上皮伤口愈合和Clytia与更复杂的动物的愈合非常相似。因此，我们可以从这个系统中学到很多关于伤口愈合的机制以及它们是如何起源的。展示这些程序的将是Elizabeth Lee和研究技术员Emily Watto。

要开始伤口过程，请准备一个改进的转移移液器，用剪刀切割移液器尖端，形成一个直径约为0.5至0.7厘米的扩大开口。使用改进的转移移液管，将从已建立的息肉菌落收集的美杜莎放在凹陷滑轨上，美杜莎X伞朝上。确保足够的人造海水或ASW覆盖动物。

要在细胞内和细胞之间造成微伤口，请在动物身上放置盖玻片。盖玻片压缩中胚层，压缩组织的反弹迫使细胞略微分开。立即对动物进行成像以观察产生的微伤口。

为了形成小的上皮伤口，如前所述，使用改进的移液管将美杜莎放在凹陷滑轨上，美杜莎 X 伞朝上。使用200微升移液器吸头，轻轻刮擦美杜莎表面。轻轻刮擦可能会在基底膜上产生裂口。

用盖玻片盖住动物进行成像。放置盖玻片有时足以在不刮擦的情况下产生小的上皮伤口。按照文本中概述的步骤，使用微量移液管柱和玻璃毛细管准备显微注射针。

将空的显微注射针放入固定在微型机械手上的显微注射支架中，并切开针尖，使开口约为20至40微米。将微量注射器上的保持压力设置为零，将喷射压力设置为大约 20 磅/平方英寸。设置显微注射器以提供两秒钟的空气脉冲。

要产生大的上皮伤口，如前所述，将美杜莎放在凹陷滑梯上。使用微型机械手，将显微注射针尖调整为保持在水面上方，方法是小心地将针尖浸入水中，然后将其缩回使其靠近美杜莎的上皮表面。通过按下喷油器上的启动来脉冲空气。

在同一点重复脉冲两到四次，具体取决于尖端的宽度。吸头越大，脉冲越少。用盖玻片盖住受伤的动物，以便对大伤口进行成像。

将焦点调整到 x 伞。六边形单元格应该是透明的。手动识别伤口以对其进行成像。

启动一个程序，将图像作为电影实时收集，或者定期收集一系列图像的程序。监测进展，以确保伤口区域不会偏离视野，并且感兴趣的细胞保持聚焦。对于注射染料和药物，请按照文本中概述的步骤制作显微注射针。

使用长移液器尖端回填显微注射针头，将过量的染料或药物注射到美杜莎中。使用改进的转移移液器，将水母莎放在副伞朝上放入聚二甲基硅氧烷或PDMS注射培养皿中，并具有足够的ASW以覆盖动物。将培养皿放在解剖显微镜的载物台上。

专注于显微注射针尖，并将其推进到美杜莎附近的水中。使用微型机械手将针头压入盘中，直到它弯曲并断裂。创建大约 10 到 20 微米的尖端开口。

使用微型机械手，将针尖穿过副伞插入中胚层，而无需刺穿X伞。在显微注射器上，将保压压力设置为零，注射压力低于或等于每平方英寸20磅。注射到一个或两个象限中，在每个象限中填充一个大约四分之一面积的染料或药物点。

根据注射的染料或药物，将动物放入新鲜ASW烧杯中，以允许染料或药物扩散和孵育。为了成像，使用改进的转移移液管将美杜莎安装在凹陷载玻片上，将动物定位为X伞朝上。在这个阶段可以伤害动物以测试注射试剂的效果。

细胞内和细胞之间的微伤口在伤口闭合过程中形成小板状伪足。随后是收缩，伤口在不到一分钟的时间内愈合。小的上皮伤口也通过板状伪足的形成和板状伪足接触的延伸而愈合。

在沿着新形成的伤口接缝进行组织收缩之前，先进行快速和渐进的伤口闭合。两个小伤口的归一化愈合率表示为随时间推移占总伤口面积的百分比，表明伤口闭合动力学存在一些变化。来自14个不同伤口的数据用于建立未经治疗的动物的平均伤口愈合曲线。

在具有基底膜损伤的小伤口中，边缘细胞在受损区域周围扩散，并且间隙用钱包弦收缩闭合。当组织脱水或受损太严重而无法修复时，细胞运动可能会停止，或者整个细胞片可能会破裂。大伤口分几个阶段愈合。

边缘收缩后的边缘平滑，板状伪足形成和板状伪足的延伸接触边缘的集体细胞迁移，并且距离边缘几层细胞关闭了大间隙。通过将试剂显微注入ECM来实现细胞核和膜染色。显微注射细胞松弛素B可抑制损伤后板状伪足的形成。

轻柔地对待动物。注射试剂时，请确保显微注射针的尖端在中胚层中，并且没有完全穿过动物。目前，转基因动物正在用荧光标签蛋白制成，结合荧光和差异干扰对比显微镜将提供上皮伤口愈合中细胞事件的更清晰的图像。