本材料基于美国国家科学基金会（National Science Foundation）资助的工作。HRD-1547798 和授权号HRD-2111661。这些 NSF 赠款被授予佛罗里达国际大学，作为科学技术卓越研究中心 （CREST） 计划的一部分。这是佛罗里达国际大学环境研究所的第 1672 号贡献，这是佛罗里达国际大学的一项杰出项目。美国国立卫生研究院（National Institute of Health）根据拨款号提供了额外的支持。R21AI135469弗朗西斯科·费尔南德斯-利马（Francisco Fernandez-Lima）和格兰特·诺（Grant No.）R01HD106051本杰明·加西亚（Benjamin A. Garcia）以及美国国家科学基金会（National Science Foundation）的资助号。CHE-2127882 给 Benjamin A. Garcia。作者要感谢Mario Gomez Hernandez博士在初始方法开发过程中的初步支持。

注：组蛋白样品是使用改编自Bhanu等人（2020）12的方法提取的。
1. 样品制备
<ol><li>收获培养细胞<ol><li>当细胞汇合度达到 80% 时，使用台盼蓝排除确保它们存活。 注意：这些实验使用了HeLa S3细胞系，但这种方法可以应用于任何培养的细胞。</li>
		<li>吸出培养基，然后在每个板上涂抹 5 mL 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）。</li>
		<li>旋转板以冲洗所有残留介质，然后吸出 PBS 并涂抹 5 mL 1x PBS。</li>
		<li>用一次性细胞升降器刮擦细胞，轻轻地将细胞与平板分离。</li>
		<li>将每个细胞悬液转移到 15 mL 锥形管中。</li>
		<li>通过以800× g 离心5分钟来沉淀细胞。</li>
		<li>从细胞沉淀中吸出PBS。</li>
		<li>继续进行组蛋白提取。 注意：如果不能立即处理，请在液氮中快速冷冻细胞沉淀。将颗粒储存在-80°C，直到准备继续。</li>
	</ol></li>
	<li>组蛋白提取<ol><li>估计每个细胞沉淀的体积，并用永久性标记标记半月板。</li>
		<li>为所有样品准备足够的核分离缓冲液（NIB;15 mM Tris-HCl （pH 7.5）、15 mM NaCl、60 mM KCl、5 mM MgCl2、1 mM CaCl2 和 250 mM 蔗糖）。或者，如果随着时间的推移需要处理许多样品，则将缓冲液散装并在2-8°C下储存长达6个月，或者通过仅解冻每次提取所需的量，在-15°C至-25°C下无限期地等分并冷冻。 注意： 缓冲液在储存过程中应保持透明。如果缓冲液在任何时候出现浑浊或其他异常外观，请丢弃并准备新的缓冲液。</li>
		<li>制备50倍体积的洗涤缓冲液的细胞沉淀，并按如下方式加入抑制剂（每2个样品约10mL洗涤缓冲液）。<ol><li>要制备 10 mL 洗涤缓冲液，请混合 10 mL NIB、30 μL 200 mM 4-（2-氨乙基）苯磺酰氟盐酸盐 [AEBSF]、10 μL 1 M 二硫苏糖醇 [DTT]、20 μL 5 μM 微囊藻毒素、20 μL 5 M 丁酸钠。</li>
		</ol></li>
		<li>取出 1/5 的洗涤缓冲液以制备裂解缓冲液（洗涤缓冲液的 1/5 体积，0.3% NP-40 或 NP-40 替代品）。 注意：请勿使用 Triton-X 100 代替 NP-40 或 NP-40 替代品，因为它对于某些细胞类型可能过于粗糙。</li>
		<li>将细胞沉淀悬浮在5列洗涤缓冲液中，并在4°C下以800× g 离心5分钟，彻底洗涤细胞沉淀。 完成此步骤两次，在洗涤之间吸出并丢弃上清液。</li>
		<li>确保细胞沉淀的体积仍用永久性标记标记。重悬于10体积的裂解缓冲液中。</li>
		<li>将每个沉淀彻底混合以重悬，然后在冰上孵育15分钟。</li>
		<li>15分钟后，在4°C下以800× g 离心5分钟。</li>
		<li>吸出并弃去上清液。 注意： 颗粒应减小到原始颗粒尺寸的 ≤ 1/2 （如标记线所示）。如果沉淀没有充分减少，请重复裂解过程，并包括使用研杵打开细胞的温和均质化步骤。</li>
		<li>裂解完成后，将沉淀重悬于500μL洗涤缓冲液中，然后在4°C下以800× g 离心5分钟。 吸出并弃去上清液，然后再次重复洗涤步骤以去除所有痕量的NP-40。 注意：此时，沉淀由染色质组成，染色质含有组蛋白。</li>
		<li>将沉淀重悬于0.4N H2SO4的5体积（原始细胞沉淀大小）中。</li>
		<li>使用搅拌器在冷藏室或冰箱中孵育2小时。</li>
		<li>2小时后，将样品在4°C下以3400× g 离心5分钟。 不要丢弃上清液。</li>
		<li>将上清液转移到新管中，并将100%三氯乙酸（TCA）加标至内容物体积的1/3（最终TCA浓度约为20%）。</li>
		<li>轻轻地倒置试管，观察透明、无色的溶液变成白色和/或浑浊，表明蛋白质沉淀。 注意：对于组蛋白浓度低的溶液，蛋白质沉淀可能不会立即引起注意，但在孵育过夜后应可见沉淀。</li>
		<li>在4°C下无干扰孵育过夜（12-18小时）以完全沉淀组蛋白。</li>
		<li>第二天，在4°C下以3400× g 离心5分钟。</li>
		<li>吸入上清液，注意不要用移液器吸头接触试管的侧面。在这个阶段，组蛋白主要以膜的形式沉积在管的两侧。</li>
		<li>使用玻璃巴斯德移液管向每个试管中加入 500 μL 冰冷丙酮 + 0.1% HCl（酸性丙酮），然后轻轻倒置试管数次。这样做时按顺序排列样品（1、2、3 等），因为任何错误的丙酮都可能去除试管上的标记。在4°C下以3400× g 离心5分钟，并轻轻倾析上清液。</li>
		<li>用 500 μL 冰冷的 100% 丙酮和玻璃巴斯德移液管重复此冲洗步骤。在4°C下以3400× g 离心5分钟，并轻轻倾析上清液。</li>
		<li>在室温下将试管打开干燥，直到剩余的丙酮蒸发。</li>
		<li>干燥后，向每个试管中加入 100 μL 质谱 （MS） 级水。使用此液滴擦拭容器的所有侧面，以重悬整个组蛋白膜。为此，将液滴移液到试管的侧面并旋转它，同时上下移液或分配 100 μL 的一半并使用尖端搅拌它。两种方法的组合效果最好。组蛋白易溶于水，并将存在于溶液中。</li>
		<li>重悬所有样品后，如果有任何残留的白色固体，则在室温下在浴中超声处理5分钟。</li>
		<li>在4°C下以800× g 离心5分钟。 将澄清溶液转移到新鲜试管中。丢弃任何剩余的不溶性颗粒。</li>
		<li>在还原条件下运行 SDS-PAGE，以验证提取是否干净。 注意：凝胶可以使用任何适当浓度的聚丙烯酰胺运行，只要它可以区分10-20kDa范围内的蛋白质。有关本方案中使用的凝胶，请参阅 材料表。</li>
		<li>进行蛋白质浓度测定（即Bradford或BCA）以确定总蛋白质浓度。</li>
	</ol></li>
	<li>赖氨酸残基的化学衍生化（丙酰化）<ol><li>将20μg组蛋白（通过蛋白质测定法测定）转移到干净的管中。使用真空浓缩器将样品干燥至 <5 μL，然后使用 20 μL 100 mM 碳酸氢铵 （NH4CO3）（~1 μg/μL 溶液）重悬。如果需要，使用氢氧化铵将pH调节至~8。 注意：不要使用氢氧化铵 （NH4OH） 进行复苏，仅在必要时调整 pH 值。否则，蛋白质会变性并沉淀。 注意：要以最小的样品损失检查pH值，请使用移液器吸头浸入样品并轻拍到pH试纸上。该测试程序将在剩余的样品制备步骤中有用。</li>
		<li>通过以 1：3 （v/v） 的比例将丙酸酐加入乙腈 （ACN） 来制备丙酰化试剂（即，要制备 40 μL 试剂，将 10 μL 丙酸酐与 30 μL 乙腈混合）。 注：传统上，甲醇或异丙醇已用于制备丙酰化试剂。由于丙酰化是酰胺生成反应，因此需要非质子溶剂（如乙腈）来防止不必要的副产物和反应，例如因使用甲醇而产生的丙酰甲酯。一次最多只能为多达 4 个样品准备足够的丙酰化试剂，以便试剂保持新鲜。在制备后1-2分钟内使用试剂。当试剂放置时，丙酸酐会与任何环境水分发生反应，乙酸将开始形成，这会改变试剂的有效性，并在添加试剂后改变组蛋白溶液的pH值。</li>
		<li>以 1：4 （v/v） 的比例向每个样品中加入丙酰化试剂（即，对于 20 μL 组蛋白，加入 5 μL 丙酰化试剂）。</li>
		<li>快速加入 1：5 （v/v） NH4OH（即，加入 4 μL 以获得 20 μL 组蛋白溶液），使溶液的 pH 值重新建立至 ~8。如果 pH 值仍然过低，则一次加入 1-2 μL NH4OH，直至 pH 值达到 8。通常，1：5 （v/v） 的比率就足够了。</li>
		<li>将样品在室温下孵育15分钟，不受干扰。</li>
		<li>每批丙酰化试剂不超过3-4个样品重复丙酰化反应，以确保最小的酸形成。</li>
		<li>重复丙酰化程序步骤1.3.2-1.3.5。第二轮丙酰化确保>95%的可用赖氨酸被衍生化。</li>
		<li>使用真空浓缩器将样品干燥至 <5 μL。这将蒸发任何未反应的丙酰化试剂、酸产物和从 NH4OH 释放的氨气。如果样品完全干燥，这很好，因为不会发生明显的样品损失。 注意： 储存前用氩气置换丙酸酐瓶中的空气，以防止由于与瓶中残留的环境水分接触而形成乙酸。</li>
	</ol></li>
	<li>胰蛋白酶蛋白水解消化<ol><li>将组蛋白重悬于100mM NH4HCO3 中，以达到20μL的体积，达到1μg/μL的最佳浓度。 注意：浓度低于 1 μg/μL 的样品溶液会导致胰蛋白酶效率降低。</li>
		<li>将胰蛋白酶以 1：10 的比例 （wt/wt） 添加到组蛋白样品中（即，将 2 μL 的 1 μg/μL 胰蛋白酶溶液加入 20 μg 组蛋白）。</li>
		<li>将反应在37°C孵育6-8小时。或者，在室温下孵育过夜（12-18小时）。</li>
		<li>通过在-80°C下冷冻至少1小时来停止消化。 注意：不要使用酸来淬灭消化反应，因为这会导致在程序的这一点上出现不必要的 pH 值下降。样品可以储存在-80°C，直到准备进行（临时停止点）。</li>
	</ol></li>
	<li>肽N端的化学衍生化（丙酰化）<ol><li>使用真空浓缩器将样品干燥至 <5 μL。</li>
		<li>使用 100 mM NH4HCO3 重悬样品至 20 μL （1 μg/μL）。</li>
		<li>像以前一样重复丙酰化（步骤1.3）。 注意：由于水性：有机物相比较高，因此样品在此步骤中需要更长的时间才能干燥是正常的。</li>
	</ol></li>
	<li>使用载物台提示进行样品脱盐<ol><li>用 50 μL MS 级水 + 0.1% TFA 重悬或稀释样品。</li>
		<li>使用 11-G 样品取芯器，从固相萃取盘中打入 5 个 C18 材料盘（在转移到移液器吸头之前打孔所有 5 个盘）。插入并确保圆盘牢固均匀地楔入200μL移液器吸头的底部（图1）。 注意：如果通过单个载物台尖端对超过 25 μg 样品进行脱盐，请使用 15-G 取芯器。</li>
		<li>使用离心机适配器将载物台尖端固定在 1.5 mL 或 2 mL 微量离心管中。 注意：对于以下离心步骤，在4°C下使用缓慢（500-500× g）旋转，一次1-2分钟;溶剂通常在不到 1 分钟的时间内通过树脂，具体取决于 C18 材料在吸头中的紧密程度。</li>
		<li>用 50 μL 100% 乙腈离心冲洗树脂，以活化 C18 材料并去除潜在的污染物。 注意：使用凝胶加载移液器吸头将溶液加载到载物台吸头上可能更容易。一旦 C18 材料被激活，重要的是在脱盐过程期间不要让树脂变干。</li>
		<li>通过离心用 80 μL MS 级水 + 0.1% TFA 平衡圆盘材料。</li>
		<li>使用冰醋酸将样品酸化至pH 4或更低。像以前一样用pH试纸检查pH值，以尽量减少样品损失。</li>
		<li>通过缓慢离心将整个样品加载到树脂盘上。</li>
		<li>通过离心用 80 μL MS 级水 + 0.1% TFA 洗涤样品。</li>
		<li>通过缓慢离心冲洗 70 μL 75% 乙腈和 0.5% 乙酸，将样品洗脱到干净的 1.5 mL 管中。可以使用额外的离心时间来确保从载物台尖端洗脱出全部样品体积。如果树脂在额外的离心时间内变干，也没关系，因为在样品洗脱后不再需要树脂。</li>
		<li>在真空浓缩器中完全干燥每个样品。 注意：样品可以储存在-80°C，直到准备好继续（临时停止点）。</li>
		<li>对于LC-MS/MS分析，将样品在液相色谱（LC）方案的溶剂A（0.1%甲酸）中复溶，最终浓度为0.4μg/μL（即，将20μg组蛋白溶解在50μL溶剂A中）。</li>
	</ol></li>
</ol>2. TIMS软件界面
<ol><li>选择 “仪器 ”选项卡并切换到 “操作 ”（验证仪器名称是否以绿色突出显示）（图 2）。</li>
	<li>验证 TIMS 参数（图 2）。</li>
	<li>验证MS设置（扫描开始，扫描结束，离子极性，扫描模式）（图2）。</li>
	<li>验证 TIMS 设置（模式、迁移率启动、迁移结束、斜坡时间、累积时间、占空比、斜坡速率、MS 速率、MS 平均值和自动校准）（图 2）。</li>
	<li>转到 “源 ”选项卡并激活注射器选项（Hamilton 500 μL），仅用于 TuneMix 校准步骤（图 3）13。</li>
	<li>进入 校准 选项卡，单击 m/z，选择 校准模式，然后选择模式（通常为增强 Q），缩放 （+0.01%） STD Dev （0.24），然后单击 校准;当得分达到 100% 时，接受（图 4）。</li>
	<li>转到移动性选项卡并重复校准过程（通常为线性模式）、检测范围 （+5%）、宽度 （0.1 Da）、STD Dev （0.1855），然后单击校准;当您得到 98.5% ≥分数时，接受（图 5）。</li>
	<li>转到该方法并选择要使用的方法;在本例中，选择 Proteomic_/2023-01-19-CF/20230119-Hela Control histone_prep_pasefDIA_1-24_1_451.d/451.m-TimsControl （图5）。</li>
</ol>3. LC-TIMS-PASEF-ToF 毫秒/毫秒联用
<ol><li>使用典型的 nESI 操作条件：4500 V 毛细管电压、800 V 端板偏移、3.0 bar 雾化器压力、10.0 L/min 干气、200 °C 干加热器和 50 μL/min 注射流速。</li>
	<li>使用典型的 MS 设置：6 eV 碰撞能量、1200 Vpp 碰撞射频、75 μs 传输时间、5 μs 预脉冲存储。</li>
	<li>使用入口漏斗 P1 和出口漏斗 P2 的压力差确定漂移气体流量。平行积累-连续碎裂 （PASEF） 发生在 TIMS 池中，同时积累所有母离子而不是单独积累。然后，母离子以较窄的离子峰释放，而通常的离子峰要宽得多（约短50倍），从而提高了信噪比，同时仍通过淌度14分离共洗脱肽。</li>
	<li>开发用于分析蛋白水解组蛋白肽的LC-TIMS-ToF MS/MS方法。将配备C18 （300 Å， 5 μm， 4.6 mm x 250 mm）色谱柱的高效液相色谱仪（HPLC）与采用专有PASEF技术的商用TIMS-TOF MS仪器相结合。 注：根据先前发表的工作15,16,17，确定该色谱柱尺寸可在高pH值和低pH值下为肽混合物提供良好的分离。<ol><li>将进样体积设置为 20 μL （8 μg） 样品和 0.4 mL/min 流速。</li>
		<li>使用含有0.1%甲酸（溶剂A）的水和含有0.1%甲酸（溶剂B）的乙腈进行60分钟的非线性LC梯度。设置梯度：10% B 2.7 分钟，然后在 5.3 分钟内降至 20% B，4 分钟内降至 28% B，再过 18 分钟降至 35% B，13 分钟内降至 40% B，再过 2 分钟降至 100% B。保持100%B5分钟后，在5分钟内将浓度降低至10%B，并保持最后5分钟。</li>
	</ol></li>
	<li>在正电离模式下，通过纳米电喷雾电离 （nESI） 验证样品从 HPLC 洗脱到 TIMS-TOF 中的情况。</li>
</ol>4. 数据分析
<ol><li>鉴定肽序列和修饰位点。<ol><li>在MS酶解工具下使用ProteinProspector [https://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msdigest]制备肽的理论列表。<ol><li>进行理论酶解，同时考虑酶解条件（使用的酶）、要搜索的 PTM 类型（例如，单甲基化、二甲基化或三甲基化）、要搜索的肽的大小范围以及质量检测范围和潜在的漏解次数。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>根据理论肽手动分析采集的数据（图6）12。<ol><li>搜索每个理论肽的多个电荷态（+1 至 +4）的质量数。</li>
		<li>在对每个 m/z 进行初步鉴定后，选择峰，并使用基于肽序列（包括PTM）的碎裂离子理论列表确认MS/MS。 注意：如果以前已知鉴定肽的迁移率，则也证实了这一点。</li>
	</ol></li>
	<li>计算各种PTM的相对丰度，并将每个修饰报告为指定肽序列的百分比。<ol><li>使用以下公式计算每个检测到的PTM的相对丰度： 相对丰度 = 给定肽的 PTM 面积/未修饰和 PTM 的总面积</li>
	</ol></li>
</ol>

组蛋白组学分析和翻译后修饰表征

<ol>
	<li>Zhao, Z., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+modifications+of+histones+in+cancer.">Epigenetic modifications of histones in cancer.</a> Genome Biology. 20, 245 (2019).</li><li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargen, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+&#197;+resolution.">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 &#197; resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li><li>Bentley, G. A., Lewit-Bentley, A., Finch, J. T., Podjarny, A. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+review+of+bottom-up+proteomics:+The+good,+the+bad,+and+the+future+of+this+field.">A critical review of bottom-up proteomics: The good, the bad, and the future of this field.</a> Proteomes. 8 (3), 14 (2020).</li><li>Ho, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bottom-up+structural+proteomics:+cryoEM+of+protein+complexes+enriched+from+the+cellular+milieu.">Bottom-up structural proteomics: cryoEM of protein complexes enriched from the cellular milieu.</a> Nature Methods. 17 (1), 79-85 (2020).</li><li>Eickbush, T., Moudrianakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histone+core+complex:+an+octamer+assembled+by+two+sets+of+protein-protein+interactions.">The histone core complex: an octamer assembled by two sets of protein-protein interactions.</a> Biochemistry. 17 (23), 4955-4964 (1978).</li><li>Sadakierska-Chudy, A., Filip, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+view+of+the+epigenetic+landscape.+Part+II:+Histone+posttranslational+modification,+nucleosome+level,+and+chromatin+regulation+by+ncRNAs.">A Comprehensive view of the epigenetic landscape. Part II: Histone posttranslational modification, nucleosome level, and chromatin regulation by ncRNAs.</a> Neurotoxicity Research. 27 (2), 172-197 (2015).</li><li>Tan, H. T., Low, J., Lim, S. G., Chung, M. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+autoantibodies+as+biomarkers+for+early+cancer+detection.">Serum autoantibodies as biomarkers for early cancer detection.</a> The FEBS Journal. 276 (23), 6880-6904 (2009).</li><li>Huang, R. X., Zhou, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+response+pathways+and+targets+for+radiotherapy+sensitization+in+cancer.">DNA damage response pathways and targets for radiotherapy sensitization in cancer.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 60 (2020).</li><li>Dantuma, N. P., van Attikum, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+regulation+of+posttranslational+modifications+in+the+DNA+damage+response.">Spatiotemporal regulation of posttranslational modifications in the DNA damage response.</a> The EMBO Journal. 35 (1), 6-23 (2016).</li><li>Tanner, S., Pevzner, P. A., Bafna, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unrestrictive+identification+of+posttranslational+modifications+through+peptide+mass+spectrometry.">Unrestrictive identification of posttranslational modifications through peptide mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 1 (1), 67-72 (2006).</li><li>Dolan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC+column+problems+everywhere+1.">LC column problems everywhere 1.</a> LCGC North America. 28 (9), 500-504 (2015).</li><li>Brusniak, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+current+bioinformatic+solutions+for+analyzing+LC-MS+data+acquired+by+selected+reaction+monitoring+technology.">An assessment of current bioinformatic solutions for analyzing LC-MS data acquired by selected reaction monitoring technology.</a> Proteomics. 12 (8), 1176-1184 (2012).</li><li>Cham, J. A., Bianco, L., Bessant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+computational+resources+for+designing+selected+reaction+monitoring+transitions.">Free computational resources for designing selected reaction monitoring transitions.</a> Proteomics. 10 (6), 1106-1126 (2010).</li><li>Colangelo, C. M., Chung, L., Bruce, C., Cheung, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+software+tools+for+design+and+analysis+of+large+scale+MRM+proteomic+datasets.">Review of software tools for design and analysis of large scale MRM proteomic datasets.</a> Methods. 61, 287-298 (2013).</li></ol>

Melvin A. Park 和 Matthew Willetts 是 timsTOF 仪器制造商 Bruker Daltonics Inc. 的员工。

组蛋白是碱性蛋白质，通过以八聚体的形式与 DNA 相互作用来调节染色质结构，八聚体由四个核心组蛋白（H2A、H2B、H3 和 H4 各两个）组成）20。组蛋白含有许多赖氨酸和精氨酸残基，这些残基很容易被修饰，导致广泛的 PTM，通过影响组蛋白功能或与其他细胞蛋白结合来改变染色质化学21。PTM 可以通过协同工作来引发生物反应，在几种疾病中已经报道了特定的 PTM...

在真核细胞中，DNA 被包装成染色质，形成称为核小体的功能单元。这些单元由四个核心组蛋白（H2A、H2B、H3 和 H4 各两个）的八聚体组成1,2,3,4。组蛋白是真核生物中最丰富和高度保守的蛋白质之一，主要负责基因调控5.组蛋白翻译后修饰 （PTM） 在染色质动力学的调节和操纵各种生物过程（如 DNA 转录、复制和修复）中起着重要作用6。PTM 主要发生在与 DNA 3,7 接触的组蛋白 N 末端区域的可触及表面上。然而，尾部和核心修饰会影响染色质结构，改变核小体间相互作用并募集特定蛋白 3,8。
在基于液相色谱-质谱（LC-MS）的蛋白质组学中，当前的一个挑战是目标分析物的潜在共洗脱。在数据依赖性分析（DDA）的情况下，这意味着在MS/MS采集过程中，几个母离子的潜在损失9。飞行时间 （ToF） 仪器以非常高的频率 9,10（高达数十 kHz）11 获取频谱;这使得它们能够快速扫描复杂样品 （MS1） 中的总母离子，从而有望实现最佳灵敏度和 MS/MS 测序速率（高达 100 Hz）9，并使其成为生物样品分析的理想选择 10。然而，在这些高扫描速率下可用的灵敏度受到 MS/MS速率 9 的限制。结合捕获离子淌度谱（TIMS）和正交四极杆飞行时间（qToF）质谱仪，可以减轻这些局限性。在 TIMS 中，所有前驱离子都串联积累并洗脱作为其迁移率的函数，而不是选择具有四极杆9 的单个前驱体质量数。并行累积-串行碎片 （PASEF） 允许每秒处理数百个 MS/MS 事件，而不会损失任何灵敏度9。
这项工作的主要目的是展示 DDA 的最新发展，使用迁移阱中的平行积累，然后是顺序碎裂和碰撞诱导解离 （CID）。组蛋白 PTM 根据其保留时间 （RT）、迁移率和碎裂模式进行可靠分配。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>-80 &#176;C Freezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Animal Origin-Free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Pipette Tips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>94060710</td>
			<td>Finntip Flex 1000 &#956;L, nonsterile, nonfiltered, racked tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-282-300</td>
			<td>Use these tubes for the simple and safe processing of sample volumes up to 1.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L Pipette Tips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>94060100</td>
			<td>Finntip Flex, 10 &#956;L, nonsterile, non-filtered, racked</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% NP-40</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>28324</td>
			<td>NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Dulbecco&#8217;s PBS without Ca2+/Mg2+</td>
			<td>(Mediatech)</td>
			<td>MT21031CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352196</td>
			<td>Falcon Conical Centrifuge Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L Gel-Loading Pipette Tips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-138</td>
			<td>Fisherbrand&#160;Gel-Loading Tips, 1&#8211;200 &#956;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L Pipette Tips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>94060310</td>
			<td>Finntip Flex 200&#956;L, nonsterile, nonfiltered, racked tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610737</td>
			<td>Premixed protein sample buffer for SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>Falcon Conical Centrifuge Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well flat bottom plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12565501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate, V-Bottom 600 &#956;L</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>P-DW-500-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td>ACS reagent, &#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (ACN)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A998</td>
			<td>HPLC, Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LS120</td>
			<td>Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AEBSF</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>328110500</td>
			<td>AEBSF hydrochloride, 98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate, NH4HCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>09830</td>
			<td>BioUltra, &#8805;99.5% (T)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide solution, NH4OH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AX1303</td>
			<td>Meets ACS Specifications, Meets Reagent Specifications for testing USP/NF monographs GR ACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Argon (Ar)</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>AR HP 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEH C18 HPLC column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003625</td>
			<td>XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 &#197;, 5 &#181;m, 4.6 mm X 250 mm, 1K&#8211;15K</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Heat shock fraction, pH 7, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>Anhydrous, powder, &#8805;97%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell dissociation buffer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13151014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic scoring wafer</td>
			<td>Restek</td>
			<td>20116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compass DataAnalysis 6.0</td>
			<td>Bruker Datonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compass HyStar 6.2</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compass IsotopePattern</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compass timsControl 4.1</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deep Well, 96-Well Microplate, 2.0 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89237526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Cell Lifters</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;08100240</td>
			<td>Fisherbrand Cell Lifters; Disposable lifters quickly remove cell layers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pellet Pestles</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-141-363</td>
			<td>Fisherbrand&#160;Pellet Pestles; Resuspend protein and DNA pellets or grind soft tissue in microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P2325</td>
			<td>1 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>695076</td>
			<td>ACS reagent, &#8805;96%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillary 75 &#956;m ID x 363 &#956;m OD</td>
			<td>(Molex (Polymicro)</td>
			<td>TSP075375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A38S</td>
			<td>Acetic Acid, Glacial (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur Pipettes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>BR747725-1000EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatograph</td>
			<td>&#160;Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>Shimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid, HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td>ACS reagent, 37%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypercarb 30-40 &#956;m Carbon 150&#8211;300 &#197;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>60106-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypersep cartridge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>60109-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC/MS Calibration Standard, for ESI-ToF</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G1969-85000</td>
			<td>TuningMix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Anhydrous, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, for HPLC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A454</td>
			<td>Optima for HPLC, Fisher Chemical&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tube Adapters</td>
			<td>GL Sciences</td>
			<td>501021514</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcystin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50-200-8727</td>
			<td>Enzo Life Sciences&#160;Microcystin-LA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS sample vial, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mm</td>
			<td>LEAP PAL Parts</td>
			<td>LAP.11190933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>model: ND3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen (N2)</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>NI UHP300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEAKS Studio X+</td>
			<td>Bioinformatic Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH indicator strips, Instachek</td>
			<td>Micro Essential Lab</td>
			<td>JR-113</td>
			<td>Model: Hydrion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride, KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>ACS reagent, 99.0%&#8211;100.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Injection Cell</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>&#160;model: PC77</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic Anhydride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>8.00608</td>
			<td>For synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge (700&#8211;18,000 x g)</td>
			<td>NuAire, model: Nuwind</td>
			<td>NU-C200V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 &#956;m, 3 g</td>
			<td>ESI Source Solutions</td>
			<td>r13.aq.0003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE Gels</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>4569035</td>
			<td>Any kD precast polyacrylamide gel, 8.6 cm &#215; 6.7 cm (W &#215; L), for use with Mini-PROTEAN Electrophoresis Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium butyrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11079.06</td>
			<td>98+%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride, NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>ACS reagent, &#8805;99.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPE disk, C18</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76333-134</td>
			<td>Empore SPE disk, C18, CDS Analytical, 90 mm x 0.5 mm, 12 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedVac+ vacuum pump and plate rotor</td>
			<td>Savant</td>
			<td>model: SC210A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.07651</td>
			<td>suitable for microbiology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric acid, H2SO4&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>339741</td>
			<td>99.999%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIMS-ToF Mass Spectrometer</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td></td>
			<td>model Tims tof ms</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid solution, TCA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T0699</td>
			<td>6.1&#160;N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>302031</td>
			<td>Suitable for HPLC, &#8805;99.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triversa Nanomate</td>
			<td>Advion</td>
			<td>model: TR263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypsinProtease, MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>90057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rotator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88881001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88880017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LS118</td>
			<td>Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

histone modification screening using liquid chromatography, trapped ion mobility spectrometry, and time-of-flight mass spectrometry

组蛋白在真核生物中高度丰富且保守，并且由于称为翻译后修饰 （PTM） 的结构，在基因调控中发挥着重要作用。参考外部或遗传因素确定每个 PTM 或 PTM 模式的位置和性质，可以使这些信息与生物反应（如 DNA 转录、复制或修复）进行统计相关。在本工作中，描述了一种用于检测生物样品中组蛋白PTMs的高通量分析方案。使用互补液相色谱法、俘获离子淌度谱法和飞行时间质谱法 （LC-TIMS-ToF MS/MS） 可以在单次分析中分离和分配最具生物学相关性的修饰。所描述的方法利用了相关数据采集 （DDA） 的最新发展，使用迁移阱中的平行积累，然后是顺序碎片化和碰撞诱导的解离。组蛋白 PTM 根据其保留时间、迁移率和碎片模式进行可靠分配。

In eukaryotic cells, DNA is packaged as chromatin into functional units called nucleosomes. These units are composed of an octamer of four core histones (two each of H2A, H2B, H3, and H4)1,2,3,4. Histones are amongst the most abundant and highly conserved proteins in eukaryotes, which are largely responsible for gene regulation5. Histone posttranslational modifications (PTMs) play a large role in the regulation of chromatin dynamics and rigger various biological processes such as DNA transcription, replication, and repair6. PTMs occur primarily on the accessible surface of the N-terminal regions of histones that are in contact with DNA3,7. However, tail and core modifications influence chromatin structure, altering inter-nucleosome interactions and recruiting specific proteins3,8.
A current challenge during liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS)-based proteomics is the potential co-elution of analytes of interest. In the case of data-dependent analyses (DDA), this translates into the potential loss of several precursor ions during the MS/MS acquisition process9. Time-of-flight (ToF) instruments acquire spectra at very high frequency9,10 (up to tens of kHz)11; this makes them capable of rapidly scanning the total precursor ions within a complex sample (MS1), thus promising optimal sensitivity and MS/MS sequencing rates (up to 100 Hz)9 and making them ideal for biological sample analysis10. Nevertheless, the sensitivity available at these high scan rates is limited by the MS/MS rate9. The addition of trapped ion mobility spectrometry (TIMS) in combination with an orthogonal quadrupole time-of-flight (qToF) mass spectrometer was used to mitigate these limitations. In TIMS, all precursor ions are accumulated in tandem and eluted as a function of their mobility, rather than selecting single precursor masses with a quadrupole9. Parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF) allows for hundreds of MS/MS events per second without any loss of sensitivity9.
The principal aim of this work was to show the recent developments of DDA using parallel accumulation in the mobility trap followed by sequential fragmentation and collision-induced dissociation (CID). Histone PTMs were confidently assigned based on their retention times (RTs), mobilities, and fragmentation patterns.

作者聚焦： 通过 LC-TIMS-TOF MS/MS 和 PASEF 增强组蛋白 PTM 异构体鉴定

使用液相色谱法、捕获离子淌度谱法和飞行时间质谱法进行组蛋白修饰筛选

A method is proposed using histone extraction protocol with 95%efficiency. Together with LC-TIMS-ToF MS/MS, in a short time, it is possible to obtain a screening for those PTMs present in the histone. And above all, the possibility of separating isomers.The separation of isomeric peptides though possible using tandem mass spectrometry alone is often difficult. By incorporating TIMS, we introduce an extra dimension of separation, simplifying many positional isomer identifications. In addition, passive technology increases the sensitivity of these experiments, further improving our ability to analyze epigenetic variations.With the increased ability to identify PTM positions, there comes the ability to further determine the correlation between various environmental or biological factors, and their effects on the epigenome. Methods that improve and facilitate analysis of histones can be applied to several research areas, including medical and environmental chemistry. The dynamics of protein confirmation in native or damaged states will be established from the implementation of TIMS MS/MS with HDX.Through LC-TIMS-ToF MS/MS and Nano LC-TIMS-ToF MS/MS, the differences in PTM existing in various biological sample will be charted.

自下而上的蛋白质组学工作流程（图7）通常包括以下内容：从粗样品中提取目标蛋白质，然后定量蛋白质的浓度，然后进行分离，通常通过凝胶电泳或液相色谱法进行分馏。分馏后，使用蛋白水解酶（通常是胰蛋白酶）消化蛋白质，最后，使用已建立的数据库18对所得肽进行质谱分析和蛋白质鉴定。序列信息来自所示质荷比 （m/z） 范围内的前驱离?...

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基于液相色谱、俘获离子淌度谱和飞行时间质谱 （LC-TIMS-ToF MS/MS） 的分析工作流程，用于基于主要参数（保留时间 [RT]、碰撞截面 [CCS] 和准确的质荷比 [m/z] 比）对组蛋白修饰和鉴定进行高可信度和高度可重复性的“自下而上”分析。

Histone proteins are highly abundant and conserved among eukaryotes and play a large role in gene regulation as a result of structures known as ...

提出了一种使用组蛋白提取方案的方法，效率为95%。与LC-TIMS-ToF MS/MS一起，可以在短时间内筛选组蛋白中存在的PTM。最重要的是，分离异构体的可能性。异构肽的分离虽然可能单独使用串联质谱法，但通常很困难。通过结合TIMS，我们引入了一个额外的分离维度，简化了许多位置异构体的鉴定。此外，被动技术提高了这些实验的灵敏度，进一步提高了我们分析表观遗传变异的能力。随着识别PTM位置的能力增强，能够进一步确定各种环境或生物因素之间的相关性，以及它们对表观基因组的影响。改进和促进组蛋白分析的方法可应用于多个研究领域，包括医学和环境化学。通过使用 HDX 实施 TIMS MS/MS 将建立天然或受损状态下的蛋白质确认动力学。通过LC-TIMS-ToF MS/MS和Nano LC-TIMS-ToF MS/MS，绘制了各种生物样品中PTM的差异。

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Chemistry

Histone Modification Screening using Liquid Chromatography, Trapped Ion Mobility Spectrometry, and Time-Of-Flight Mass Spectrometry

783 次观看.  Florida International University. 提出了一种使用组蛋白提取方案的方法，效率为95%。与LC-TIMS-ToF MS/MS一起，可以在短时间内筛选组蛋白中存在的PTM。最重要的是，分离异构体的可能性。异构肽的分离虽然可能单独使用串联质谱法，但通常很困难。通过结合TIMS，我们引入了一个额外的分离维度，简化了许多位置异构体的鉴定。此外，被动技术提高了这些实验的灵敏度，进一步提高了我们分析表观遗传变?...

视频: 作者聚焦： 通过 LC-TIMS-TOF MS/MS 和 PASEF 增强组蛋白 PTM 异构体鉴定

Histone proteins are highly abundant and conserved among eukaryotes and play a large role in gene regulation as a result of structures known as posttranslational modifications (PTMs). Identifying the position and nature of each PTM or pattern of PTMs in reference to external or genetic factors allows this information to be statistically correlated with biological responses such as DNA transcription, replication, or repair. In the present work, a high-throughput analytical protocol for the detection of histone PTMs from biological samples is described. The use of complementary liquid chromatography, trapped ion mobility spectrometry, and time-of-flight mass spectrometry (LC-TIMS-ToF MS/MS) enables the separation and PTM assignment of the most biologically relevant modifications in a single analysis. The described approach takes advantage of recent developments in dependent data acquisition (DDA) using parallel accumulation in the mobility trap, followed by sequential fragmentation and collision-induced dissociation. Histone PTMs are confidently assigned based on their retention time, mobility, and fragmentation pattern.

An analytical workflow based on liquid chromatography, trapped ion mobility spectrometry, and time-of-flight mass spectrometry (LC-TIMS-ToF MS/MS) for high confidence and highly reproducible "bottom-up" analysis of histone modifications and identification based on principal parameters (retention time [RT], collision cross section [CCS], and accurate mass-to-charge [m/z] ratio).

作者聚焦： 通过 LC-TIMS-TOF MS/MS 和 PASEF 增强组蛋白 PTM 异构体鉴定

作者聚焦：通过 LC-TIMS-TOF MS/MS 和 PASEF 增强组蛋白 PTM 异构体鉴定