从高梁叶组织中分离出希石，用于自上而下质量光谱分析潜在的表观遗传标记

我们的协议揭示了高梁植物发育和抗旱的表观遗传标记。这种分子理解将有助于开发更好的解决方案，使作物适应未来的极端气候。此协议从高梁叶组织中生成高纯度组织，适用于质谱仪对转化后修饰进行无针对性的分析。

演示程序的将是沙丹·阿卜达利和塔妮娅·温克勒，来自EMSL的学士后研究助理。首先，用液氮研磨几片高梁叶，在零下80摄氏度的50毫升离心管中储存。使用大约四克叶粉对每个样品进行石块分析。

准备文本手稿中描述的提取缓冲区 1、2A 和 2B，并添加蛋白酶抑制剂片剂以提取缓冲液 1，最终浓度为 0.2 倍。然后在地叶粉末中加入20毫升的预制萃取缓冲液，轻轻混合或漩涡10分钟。使用网格 100，每次用两毫升提取缓冲液冲洗过滤材料两次。

接下来，将过滤液在3000倍G下，在4摄氏度的摆动桶转子中搅动10分钟，以颗粒状细胞碎片和大型亚细胞器。同时，通过将蛋白酶抑制剂添加到0.4倍的最终浓度中，准备提取缓冲区2A。丢弃超强剂，而不会干扰颗粒。

然后将颗粒重新悬在预制提取缓冲区2A的5毫升中。在冰上孵化10分钟，轻轻混合。在 2，100 倍 G 下将溶液在 4 摄氏度下在摆动的桶转子中搅动 15 分钟，以颗粒碎屑和核。

小心地去除超细颗粒，而不会干扰颗粒。通过将蛋白酶抑制剂添加到1X的最终浓度中，准备提取缓冲区2B。在离心后获得的颗粒中加入五毫升这种制备缓冲液。

离心机在2，100倍G为15分钟，在4摄氏度的摆动桶转子到颗粒碎片和核。同时，通过添加蛋白酶抑制剂片剂来准备核裂解缓冲。小心地在不干扰颗粒的情况下倒出超纳坦，并将颗粒重新悬浮在裂解缓冲器的250微升中。

以最大速度将溶液调高 15 秒，使其均匀化并重新悬索材料。然后在摄氏四度下声化五分钟，储存在零下八十摄氏度。解冻冷冻核样品，加入750微升5%瓜尼丁缓冲区。

然后在摄氏四度下声化15分钟。将样品转移到一个两毫升的管子中，在摄氏四度下以10，000倍G旋转10分钟。同时，用两毫升丙酮和四毫升水冲洗离子交换色谱柱，以尽量减少表面的污染。

将大约 200 到 300 微升的弱 cation 交换树脂加载到色谱柱上，让树脂沉淀下来。用瓜尼丁缓冲器清洗树脂四次，将管子和柱子放在冰上。将柱子放在一个两毫升的收集管上，将预制样品中的超纳坦慢慢加载到树脂床上，而不会干扰树脂。

当溶液流过时，将凹痕加载回柱的顶部六到八次，以便最大限度绑定到树脂上。然后加载两毫升的5%瓜尼丁缓冲区，以洗掉柱子上的非石蛋白。用一毫升5%的瓜尼丁缓冲区将石蛋白埃卢特，并收集出这种蛋白。

用 500 微升洗涤溶剂清洁三千达顿截断旋转过滤器，然后使用预先清洁的自旋过滤器脱盐剩余的溶剂。在LC-MS功能图的特定区域观察到主要的石蛋白，这表明实验的成功。这张有代表性的地图在破折号的箱子里显示了完整的全长石质。

H2B 和 16 千达顿 H2A 蛋白型的 LC-MS 功能图显示，两者都有多个具有类似序列的同源词，如唯一的产品会话数所示。可以看到另一组没有长尾的H2A组音。通过检查此处显示的 LC-MS 特征图的质量差异，可以观察到 H4 平石蛋白中的 N 端乙酰化、附加赖氨酸乙酰化和甲基氨酸氧化。

有两个蛋白质序列确定为H3石蛋白，H3.3和H3.2。电子转移分离碎片用于生成已识别的H3.2蛋白形的碎片光谱。前体离子和前一个和下一个 Ms1 光谱在这里显示，其匹配的同位素峰值以紫色突出显示。

可使用序列覆盖图本地化后转换。通过比较蛋白形成体的相对丰度，发现了与样品条件特有的截断的石蛋白表的变化。仅在第三周和第九周对一些样本进行了H4的C端截断。

对于H3.2，N端截断蛋白形成通常在第10周更为丰富。相比之下，C 端截断 H3.2 出现在较早的时间点。H4 C端截断的蛋白形成在BTx642中比在RTx430中更为丰富。

在尝试此协议时，请密切注意超纳坦和颗粒的颜色。颜色变化有助于识别叶绿体研磨或裂解中的潜在问题。我们希望，这种从高梁叶中分离出层石的稳健方案将促进其他类似植物的表观遗传学研究。