这项工作得到了西班牙科学与创新部的“Agencia Estatal de Investigación”（项目 PID2020-113371RB-C21）、IDAEA-CSIC、Severo Ochoa 卓越中心 （CEX2018-000794-S） 的支持。朱丽叶·贝德罗西安茨（Juliette Bedrossiantz）得到了西班牙政府和欧洲社会基金（ESF）共同资助的博士资助（PRE2018-083513）。

严格遵守道德标准保证了用于实验的斑马鱼的福利和适当待遇。所有实验程序均根据机构动物护理和使用委员会（CID-CSIC）制定的指南进行。下面介绍的协议和结果是在当地政府授予的许可下进行的（协议编号 11336）。
1. 用于行为测试的动物圈舍
<ol><li>在10：00至17：00之间，在27-28°C的隔离行为室中进行所有测试（如 图1所示）。</li>
	<li>在开始实验之前，在干净的鱼水中多次清洗对照鱼和暴露的鱼[含有 90 mg/L 水族箱系统盐、0.58 mM CaSO4·2H2O 和 0.59 mM NaHCO3 的反渗透纯化水]，以避免对实验罐的任何潜在污染。</li>
	<li>在开始实验前1小时使动物适应行为室。</li>
	<li>确保动物（≈50：50雄性：雌性比例）在实验上是幼稚的，并以盲目的方式进行所有行为测试，观察者不知道实验组。</li>
	<li>为了在行为测定中获得有意义的结果，每个条件总共有 18 名受试者 （n = 18），最好是在两个或多个独立实验之间获得。例如，在单个测试中，分析每个条件、每个重复的 9 只动物的行为。在组测试中，分析每个条件、每个重复 6 到 9 只动物的浅滩的行为。</li>
	<li>按照电池测试方法执行所有测试（参见 图 2 中的规划建议）。从伦理上讲，这种方法更合适，可以减少研究所需的动物数量，符合 3R 减少原则7。</li>
	<li>大多数情况下，行为测定与生物测定有关，因此在收集和分析样本（组学或化学品）之前，请按照安乐死指南18 处死动物。如果终点未被证明是采样，则在实验结束时重新稳定对照组。几天后，将对照动物重新用于育种或实验目的。</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65869/65869fig01.jpg"> 图 1：实验设置。 方形水箱的三种配置，用于研究成年斑马鱼的各种行为。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65869/65869fig01large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65869/65869fig02.jpg"> 图2：实验时间表。 记录行为测定的两个规划建议。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65869/65869fig02large.jpg" target="_blank">请点击这里查看此图的较大版本.</a>
2.罐体的实验配置
<ol><li>焦虑样行为：新型坦克测试 （NTT）<ol><li>调整实验设置（水箱、相机和计算机的数量）以同时记录最大鱼数。单个行为检测非常耗时，因此要优化时间、材料和空间。</li>
		<li>为NTT准备实验水箱：方形水箱（长20厘米，宽20厘米，高25厘米），侧壁和底部覆盖有亚克力板，以避免受试者之间的反射和干扰。</li>
		<li>在28°C下用7L（水柱高度：20cm高度）含氧良好的鱼水填充实验罐。</li>
		<li>调整水箱在相机前方的位置，以避免图像失真。</li>
		<li>检查照明设置。LED 背光 （10000 lux） 在水箱的所有部分提供均匀的照明，以便在良好条件下进行视频录制。</li>
		<li>打开相机并按照第 3 节进行调整。</li>
		<li>在开始记录之前，将受试者一个接一个地引入实验罐的底部。 注意： 重要的是在水箱底部开始记录动物。</li>
		<li>在录制过程中注意不要打扰动物。使用窗帘或面板不仅限制储罐之间的视觉互动，而且限制支架与外部之间的视觉互动。</li>
		<li>在记录结束时（标准记录时间为6分钟），将已经通过测试的动物转移到另一个水箱中，以免它们与幼稚的动物混合。</li>
		<li>对所有可用的受试者重复该过程。建议每种情况总共有 18 名受试者，以便在单个试验中获得有意义的结果（来自两个或多个独立重复）。</li>
		<li>在两次试验之间随机分配分配给每个储罐的实验组，以避免任何潜在的储罐效应（如果您同时记录多个条件）。</li>
	</ol></li>
	<li>社会群体行为：浅滩测试（ST）<ol><li>ST的实验配置与NTT相同（相同的储罐可直接重复使用）。</li>
		<li>按照步骤 2.1.1-2.1.6 操作。设置 ST。</li>
		<li>在开始记录之前，在实验罐底部引入浅滩（同时 6 到 9 名受试者）。 注意： 重要的是在水箱底部开始记录动物。</li>
		<li>按照步骤 2.1.8-2.1.11 操作。执行 ST。</li>
		<li>对所有可用的受试者重复该过程。为了在该测定中获得有意义的结果，在每次重复中至少进行两个具有相同库大小的独立重复。</li>
		<li>保持所有实验组的浅滩大小一致，并在同一实验中重复。</li>
	</ol></li>
	<li>社会个体行为：社会偏好测试（SPT）<ol><li>调整实验设置以优化实验空间和记录时间。</li>
		<li>为SPT准备实验罐：方形罐（长20厘米，宽20厘米，高25厘米）透明（玻璃或塑料）以提供横向可见性。单焦点鱼可以自由地与同种虚拟区域（放置在单侧外部住房水箱中的鱼的浅滩）或与非特定虚拟区域（单侧外部空住房水箱）进行交互。</li>
		<li>在28°C下用5L（水柱高度：15厘米，与外部住房水箱中的水柱高度相同）的清洁鱼水填充实验水箱。</li>
		<li>调整水箱在相机前方的位置，以避免图像失真。</li>
		<li>检查系统是否接收到均匀的照明。</li>
		<li>将受试者一个接一个地引入实验罐的底部，然后立即开始记录，动物在中心向下。</li>
		<li>在录制过程中避免观察者和动物之间的视觉互动。</li>
		<li>在 6 分钟记录结束时，将现在的动物转移到另一个水箱中，以免它们与幼稚的动物混合。</li>
		<li>对所有可用的受试者重复该过程。每种情况共有 18 名受试者，以在单个试验中获得有意义的结果（来自两个或多个独立重复）。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 行为测试的视频录制
<ol><li>打开相机管理器以检查每台计算机上 GigE 相机的可用性。</li>
	<li>启动GigE相机控制软件（如uEye Cockpit，此处介绍）。打开 相机 选项，选择 单色 模式，然后调整图像大小 （1：2）。</li>
	<li>打开 相机属性
	<ol><li>在 “相机”下，将 “像素时钟 ”设置为 “最大”，将 “帧速率 ”设置为“每 秒 30 帧 （fps）”，然后调整 曝光 （如果图像太暗，则“自动 ”或 “手动 ”调整）。</li>
		<li>在 “图像”下，将 增益 设置为 0 （自动）和 “黑色电平 ”（自动 或 手动 调整以获得良好的对比度）。</li>
		<li>在 “大小”下，将窗口的大小调整为需要雕刻的区域（宽度：宽度-左侧，高度：高度-顶部）。此步骤可以减小图像的大小，从而减小视频的最终大小。</li>
		<li>关闭 相机属性。</li>
	</ol></li>
	<li>为实验会话创建一个常规文件夹，以保存相机设置和视频。</li>
	<li>要保存相机设置，请设置 “文件”>“将参数>保存到文件 ”，然后选择最近创建的实验文件夹。 注意：因此，可以在应用程序中重新加载相机设置文件，以便随时继续使用相同的图像参数（例如，当相机突然关闭或重复使用相同的设置时，减少设置时间并使实验条件均匀化）。如果在某一时刻，相机在视频之间冻结，请停止录制、退出并关闭相机。重新打开它，通过转到 “文件”>“加载参数>到文件”重新加载相机参数，然后重新开始录制。检查当前视频是否已被完全获取以丢弃或重复鱼（在重复之前，给动物一些时间重新适应环境）。</li>
	<li>在所有摄像机上重复此摄像机设置步骤（步骤3.1-3.5）。</li>
	<li>正确配置所有摄像机后，打开 录制视频序列。</li>
	<li>选择 “创建 ”以另存为新的视频文件，选择最近创建的实验文件夹，并以视频文件的名称报告主题信息、实验类型和日期。</li>
	<li>选择 最大帧数。在框架框中键入 10800。标准视频以 30 fps 的速度录制 6 分钟（视频 1）以 AVI 格式录制;因此，6 分钟 x 60 秒 x 30 fps = 总共 10800 帧。</li>
	<li>选择 计算帧速率 或手动指示帧速率（录制速度：30 fps）。</li>
	<li>在所有计算机上重复视频文件创建过程。</li>
	<li>在每个实验罐的底部逐个介绍主题。所有检测将立即进行。</li>
	<li>通过单击 “录制 ”快速启动记录，然后等待获取请求的最大帧数（步骤 3.10）。</li>
	<li>录制视频后，会出现一个聊天框，其中包含消息 Maximal number of frames achieved！。选择 “接受”。</li>
	<li>选择 “关闭” 以完成录制并关闭视频文件。</li>
	<li>取出刚刚观察到的鱼。小心将它们与幼稚的鱼分开。</li>
	<li>直接选择 “创建 ”并重复该过程以继续录制视频。</li>
	<li>完成所有录制后，选择 退出。</li>
	<li>要关闭相机，请选择 关闭相机 并 退出 程序。</li>
</ol>4. 录制视频分析
<ol><li>启动分析软件（参见 材料表）。</li>
	<li>要详细说明新模板，请单击“ 从模板新建”>“应用了预定义的模板”>“从视频文件”，然后选择一个视频以开始设置模板。尝试选择具有代表性的实验视频，其受试者表现出良好的移动性和良好的录制条件。</li>
	<li>在 “参数”中，配置以下窗口中的参数（1 到 4/7）。选择模型 Fish > Adult Zebrafish、竞技场 Open Field Square > One Arena、 每个竞技场的对象数量（对于 ST，需要多跟踪包 [在一个竞技场中跟踪多个对象]）、 中心点检测 类型，最后将帧速率调整为 30 fps。在以下窗口（5 到 7/7）中，不要更改参数;默认配置为“正常”。</li>
	<li>将实验命名为模板，并将其与存储视频的其余部分放在同一文件夹中。该模板将被创建为一个实验文件夹，其中包含包含所有设置信息的多个细分。</li>
	<li>在 “实验设置”下，检查定义的设置（来自视频文件、竞技场、受试者数量、每秒帧数）。在这里，可以修改系统单元。</li>
	<li>在 “竞技场设置”下，右键单击屏幕中央，然后选择 “抓取”。 从显示中的文件 。选择质量良好的视频图像并 接受 以捕获此图像以进行背景设置。首先， 校准 图像，生成校准规则。使用水箱的宽度作为刻度（19 厘米）。然后，绘制竞技场。注意使正方形刚好，以避免当动物接近水面时动物的反射，或者最终将鱼软件与鱼缸的黑色区域混淆。最后，使用 Frame 函数绘制形状区域。<ol><li>对于 NTT 和 ST， 将储罐的前部划分为两个相等的虚拟区域，顶部和底部（见 图 1）。绘制两个相等的水平框。每个盒子都覆盖了半个竞技场。分别命名上部和下部区域的 顶部 和 底部 。请注意，盒子的宽度（9-10 厘米）和长度（8-9 厘米）相同，不要超过竞技场边界（橙色正方形），并且不要重叠，检查每个箭头区域是否准确指示其区域。</li>
		<li>对于SPT，从概念上将实验场划分为三个大小相等的区域：空区、中心区和同种区（见 图1）。绘制三个相等的垂直框。将面向浅滩水箱的箱子命名为 “同种”，将朝向空水箱的箱子命名为 “空”，将中间的箱子命名为 “中心”。请注意，盒子的宽度（6 厘米）和长度（18-19 厘米）相同，不要超过竞技场限制，也不要重叠。</li>
	</ol></li>
	<li>在 “检测设置”下，验证要在 视频文件中处理的视频。然后，检查检测质量（黄色鱼，红色中心点）。单击 “自动检测 ”以调整检测，重新聚焦动物（在白色背景上选择动物在剖面上游泳的图像，通过拍摄整个身体来绘制图片，然后使用 “是”验证检测）。打开 “高级 ”，通过选择 “动态减法”、“较暗的主体”、“背景设置”、“背景学习”、“主体大小”、“降噪”等来改进检测。</li>
	<li>在 “试用设置”下，放置一个试用版并删除其他试用版（右键单击并删除）</li>
	<li>在“数据设置”下，创建“结果”对话框窗口。参数化每个时间和每个区域的结果。例如，创建一个“结果”窗口，用于按分钟输出数据，另一个窗口用于按总时间（6 分钟）输出数据。请求每个区域的数据输出（如果需要每个区域中的距离，请请求）。使用箭头将不同的“结果”窗口链接到“开始”窗口。</li>
	<li>在 “分析设置”下，选择要分析的 参数 以及每个参数的 统计信息 类型。这些参数将根据从跟踪中获取的数据自动计算。<ol><li>对于 NTT 和 SPT，选择以下定义的选项：<ol><li>选择 “移动距离 ”（选择 “总计”）可获取在竞技场中行进的距离 （cm） 和在相应区域中行进的距离 （cm）。</li>
			<li>选择 “在区域中 ”（选择“ 区域”、“频率”、“累积”和 “延迟”到“第一”），以显示在区域中花费的时间以及首次进入区域的延迟。</li>
			<li>选择 区域过渡 （选择 阈值：0 厘米， 添加区域 1 >区域 2;Zone 2 > Zone 1，在任何区域中， 频率）来获取区域中的入口数。</li>
			<li>选择 “移动状态 ”（填写“高移动”高于 70%、“不移动”低于 3%、至少 150 帧，并选择频率、累积和延迟到第一个）以获得超移动的持续时间、冻结的持续时间。 注意：有关使用自动分析的冷冻行为的近似值以及冷冻事件的数量和持续时间的更多详细信息，请参阅“讨论”部分。</li>
			<li>选择 “加速度 ”和 “转弯角度 ”（选择“频率”和“累积”）以评估复杂行为的发生，例如飞镖和不稳定（快速加速运动）。</li>
		</ol></li>
		<li>对于 ST，除了上述探索性参数外，还可以选择对象之间的距离选项（选择所有对象、平均值、最大值、最小值）以获得鱼之间的平均距离 （cm）、最近邻居之间的平均距离 （cm） 和最远邻居之间的平均距离。</li>
	</ol></li>
	<li>该模板已准备好供其使用。 保存 最后的修改并 关闭 模板，而不从视频中获取任何数据（维护模板文件;它轻巧且易于管理和复制）。如果有多个软件许可证，请分析复制到每台计算机的同一模板中的视频。</li>
	<li>若要复制和使用模板，有两个选项：<ol><li>使用行为分析软件打开模板文件，转到 “文件”>“另存为 ”以创建一个新的相同文件。</li>
		<li>在欢迎界面中，选择“ 从模板新建”>“应用了从视频文件>自定义模板 ”（选择“模板”。EthXV 文件）。为新实验命名并选择其位置。软件可能需要几分钟才能从模板文件中复制信息。</li>
	</ol></li>
	<li>如果视频是使用其他摄像机录制的，请转到 竞技场设置 以重新调整模板（按照步骤 4.6 和 4.7 操作）。</li>
	<li>转到 “检测设置 ”或 “采集 ”以检查选择了哪个视频，并在必要时更改视频文件。</li>
	<li>在 “获取”下，选择“ DDS > Ready to Start”。软件可能需要几分钟才能处理视频。</li>
	<li>采集完成后，转到 Track Editor。选择加速度 x16 可以更快地读取处理后的视频并检查跟踪是否正确。 注意： 有时，跟踪中可能会有“损失”（由于软件本身的反射或混淆）。如果它们很少，可以从这部分手动编辑它们;否则，最好对整个实验进行重新处理，提高画布的清晰度和检测效果。</li>
	<li>在 “统计信息”下，单击 “计算>导出数据”。数据导出直接位于试验文件夹中。</li>
	<li>在 跟踪可视化 或 热图下，生成并导出（右键单击，导出图像，选择实验的 文件夹导出文件 以将此数据与电子表格报告一起保存）动物的跟踪图像。</li>
	<li>转到 “文件 ”以 关闭 活动实验，然后对下一个视频重复此过程。</li>
</ol>5. 统计分析
<ol><li>分析每组数据的正态性（Shapiro-Wilk 检验）。</li>
	<li>使用 Levine 检验评估同方差关系。</li>
	<li>当不能拒绝正态性和同方差性标准时，使用单因素方差分析，然后进行 Dunnett 和 Tukey 的多重比较检验来检验组间差异。</li>
	<li>当正态性和同方差性标准被拒绝时，使用 Kruskal-Wallis 检验，然后使用 Bonferroni 校正进行成对比较，以检验组间差异。</li>
	<li>使用图形软件绘制数据。</li>
</ol>

行为的：评估成年斑马鱼神经毒性作用的测试电池

<ol>
	<li>Rald&#250;a, D., Pi&#241;a, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+zebrafish+assays+for+analyzing+drug+toxicity.">In vivo zebrafish assays for analyzing drug toxicity.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism &amp; Toxicology. 10 (5), 685-697 (2014).</li><li>Faria, M., Prats, E., Bellot, M., Gomez-Canela, C., Rald&#250;a, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+modulation+of+serotonin+levels+in+zebrafish+larvae:+Lessons+for+identifying+environmental+neurotoxicants+targeting+the+serotonergic+system.">Pharmacological modulation of serotonin levels in zebrafish larvae: Lessons for identifying environmental neurotoxicants targeting the serotonergic system.</a> Toxics. 9 (6), 118 (2021).</li><li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+for+human+acute+organophosphorus+poisoning.">Zebrafish models for human acute organophosphorus poisoning.</a> Scientific Reports. 5, 15591 (2015).</li><li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyphosate+targets+fish+monoaminergic+systems+leading+to+oxidative+stress+and+anxiety.">Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety.</a> Environment International. 146, 106253 (2021).</li><li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+anti-predator+behaviour+in+fish+larvae+exposed+to+environmental+pollutants.">Screening anti-predator behaviour in fish larvae exposed to environmental pollutants.</a> Science of the Total Environment. 714, 136759 (2020).</li><li>Faria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrylamide+acute+neurotoxicity+in+adult+zebrafish.">Acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7918 (2018).</li><li>Kalueff, A. 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M., Kalueff, A., Cachat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video-Aided+Analysis+of+Zebrafish+Locomotion+and+Anxiety-Related+Behavioral+Responses.">Video-Aided Analysis of Zebrafish Locomotion and Anxiety-Related Behavioral Responses.</a> Zebrafish Neurobehavioral Protocols. Neuromethods. 51, (2011).</li><li>Rosemberg, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+spatio-temporal+behavior+of+zebrafish+in+the+open+tank+paradigm+after+a+short-period+confinement+into+dark+and+bright+environments.">Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments.</a> PLoS ONE. 6 (5), e19397 (2011).</li><li>Blaser, R., Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+phenotyping+in+Zebrafish:+Comparison+of+three+behavioral+quantification+methods.">Behavioral phenotyping in Zebrafish: Comparison of three behavioral quantification methods.</a> Behavioral Research Methods. 38 (3), 456-469 (2006).</li><li>Cachat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+neurophenotyping+of+adult+zebrafish+behavior.">Three-dimensional neurophenotyping of adult zebrafish behavior.</a> PLoS ONE. 6 (3), e17597 (2011).</li><li>Cachat, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconstructing+adult+zebrafish+behavior+with+swim+trace+visualizations.">Deconstructing adult zebrafish behavior with swim trace visualizations.</a> Neuromethods. 51, 191-201 (2011).</li></ol>

作者声明，该研究是在没有任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

在 NTT 中观察到的特征性焦虑行为与大脑中分析的血清素水平呈正相关21.例如，在暴露于对氯苯丙氨酸（PCPA），一种5-HT生物合成的抑制剂后，鱼类表现出积极的趋向性以及大脑5-HT水平的降低22，结果与MEH获得的结果非常相似。因此，暴露于甲基苯丙胺的斑马鱼中大脑血清素水平的降低和正向地理趋向性的表现表明，药物产生的焦虑行为是由血清素能途径介导的...

斑马鱼 （Danio rerio） 是一种流行的模式脊椎动物物种，用于生态毒理学、药物发现和安全药理学研究。斑马鱼成本低廉，分子遗传工具完善，对神经系统形态发生和维持的关键生理过程的保护，使斑马鱼成为神经科学研究的理想动物模型，包括神经行为毒理学1,2。直到最近，评估化学品神经毒性的主要终点是神经病理学效应的存在。然而，最近，行为终点已被纳入神经毒理学筛查方案，这些功能结果现在通常用于识别和确定化学品的潜在神经毒性 3,4。此外，从生态学的角度来看，行为终点具有高度相关性，因为即使是鱼类非常轻微的行为变化也可能危及动物在自然条件下的生存5.
成年斑马鱼研究中最常用的行为测定之一是新型水箱测试 （NTT），它测量焦虑样行为 6,7。在这种测定中，鱼暴露于新奇事物（鱼被放置在不熟悉的水箱中），轻微的厌恶刺激并观察它们的行为反应。NTT 主要用于评估鱼类的基础运动活动、地质趋向性、冻结和不稳定的运动。飘忽不定的8 的特征是方向的突然变化（锯齿形）和反复的加速（飞镖）。这是一种警报反应，通常在冻结事件之前或之后观察到。冷冻行为对应于鱼在水箱底部时完全停止运动（鳃盖和眼部运动除外），这与镇静引起的不动不同，镇静引起的不动会导致运动减退、运动不能和下沉8.冻结通常与高度压力和焦虑状态有关，也是顺从行为的一部分。複雜行為是動物焦慮狀態的极好指標。NTT 已被证明对药理学和遗传操作敏感9，使其成为研究焦虑和相关疾病的神经基础的宝贵工具。
斑马鱼是一种高度社会化的物种，因此我们可以测量广泛的社会行为。浅滩试验 （ST） 和社会偏好试验 （SPT） 是评估社会行为最常用的检测方法10.ST 通过量化鱼类的空间行为和运动模式来测量鱼类组合在一起的趋势11。ST 可用于研究群体动态、领导力、社会学习和理解许多鱼类的社会行为12.成年斑马鱼的SPT改编自Crawley对小鼠13的社交新奇性测试的偏好，并迅速成为研究该模型物种14中社会互动的流行行为测定。这两种测试也适用于药物筛选分析，并显示出识别调节社会行为的新化合物的希望15,16。
一般来说，成年斑马鱼的行为测定是强大的工具，可以提供有关活性化合物和滥用药物的行为机制或神经表型的宝贵信息17。该协议详细说明了如何使用基本材料资源实现这些行为工具7 ，以及如何将它们应用于毒性测定以表征各种神经活性化合物的作用。此外，我们将看到，相同的测试可用于评估急性暴露于神经活性化合物（甲基苯丙胺）的神经行为影响，也可以表征长期暴露于环境浓度的杀虫剂（草甘膦）后的这些影响。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aquarium Cube shape</td>
			<td>Blau Aquaristic</td>
			<td>7782025</td>
			<td>Cubic Panoramic 10 &#160;(10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethovision software</td>
			<td>Noldus</td>
			<td>Ethovision XT</td>
			<td>Version 12.0 or newer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GigE camera</td>
			<td>Imaging Development Systems</td>
			<td>UI-5240CP-NIR-GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 9.02</td>
			<td>GraphPad software Inc</td>
			<td>GraphPad Prism 9.02</td>
			<td>&#160;For Windows</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IDS camera manager</td>
			<td>Imaging Development Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED backlight illumination</td>
			<td>Quirumed</td>
			<td>GP-G2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPSS Software</td>
			<td>IBM</td>
			<td>IBM SPSS v26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>uEye Cockpit software&#160;</td>
			<td>Imaging Development Systems</td>
			<td>version 4.90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neurotoxicity assessment in adult danio rerio using a battery of behavioral tests in a single tank

多年来，神经病理学效应的存在被证明是评估化学物质神经毒性的主要终点。然而，在过去的 50 年里，人们积极研究了化学物质对模式物种行为的影响。渐渐地，行为终点被纳入神经毒理学筛查方案，这些功能结果现在通常用于识别和确定化学品的潜在神经毒性。成年斑马鱼的行为测定提供了一种标准化和可靠的方法来研究广泛的行为，包括焦虑、社交互动、学习、记忆和成瘾。成年斑马鱼的行为测定通常涉及将鱼置于实验场中，并使用视频跟踪软件记录和分析它们的行为。鱼可以暴露在各种刺激下，它们的行为可以使用各种指标来量化。这种新型的鱼缸测试是研究鱼类焦虑样行为的最被接受和广泛使用的测试之一。浅滩和社会偏好测试有助于研究斑马鱼的社会行为。这种测定特别有趣，因为研究了整个浅滩的行为。这些检测已被证明具有高度可重复性，并且对药理学和遗传操作敏感，使其成为研究行为背后的神经回路和分子机制的宝贵工具。此外，这些测定可用于药物筛选，以鉴定可能成为行为潜在调节剂的化合物。
在这项工作中，我们将展示如何在鱼类神经毒理学中应用行为工具，分析甲基苯丙胺（一种娱乐性药物）和草甘膦（一种环境污染物）的影响。结果表明，成年斑马鱼的行为测定对理解环境污染物和药物的神经毒理学影响做出了重大贡献，此外还提供了对可能改变神经元功能的分子机制的见解。

The zebrafish (Danio rerio) is a popular model vertebrate species for ecotoxicology, drug discovery, and safety pharmacology studies. Its low cost, well-established molecular genetic tools, and conservation of key physiological processes involved in the morphogenesis and maintenance of the nervous system make zebrafish an ideal animal model for neuroscience research, including neurobehavioral toxicology1,2. The main endpoint for evaluating the neurotoxicity of a chemical was, until recently, the presence of neuropathological effects. Lately, however, behavioral endpoints have been incorporated into neurotoxicological screening protocols, and these functional outcomes are now commonly used to identify and determine the potential neurotoxicity of chemicals3,4. Moreover, behavioral endpoints are highly relevant from an ecological point of view, as even a very mild behavioral change in fish could endanger the survival of the animal in natural conditions5.
One of the most used behavioral assays in adult zebrafish research is the novel tank test (NTT), which measures anxiety-like behavior6,7. In this assay, fish are exposed to novelty (fish are placed in an unfamiliar tank), a mild aversive stimulus and their behavioral responses are observed. NTT is used to assess basal locomotor activity, geotaxis, freezing, and erratic movements of fish, principally. Erratic8 is characterized by abrupt changes of direction (zigzagging) and repeated episodes of accelerations (darting). It is an alarm reaction and is usually observed before or after freezing episodes. Freezing behavior corresponds to a complete cessation of the fish&#39;s movements (except for opercular and ocular movements) while on the bottom of the tank, as distinguished from immobility caused by sedation, which causes hypolocomotion, akinesia, and sinking8. Freezing is usually related to a high state of stress and anxiety and is also part of submissive behavior. Complex behaviors are excellent indicators of the state of anxiety of animals. NTT has been shown to be sensitive to pharmacological and genetic manipulation9, making it a valuable tool for studying the neural basis of anxiety and related disorders.
Zebrafish are a highly social species, so we can measure a wide range of social behaviors. The shoaling test (ST) and the social preference test (SPT) are the most used assays to assess social behavior10. The ST measures the tendency of fish to group together11 by quantifying their spatial behavior and movement patterns. ST is useful for studying group dynamics, leadership, social learning, and understanding the social behavior of many fish species12. The SPT in adult zebrafish was adapted from Crawley&#39;s preference for social novelty test for mice13&#160;and quickly became a popular behavioral assay for the study of social interaction in this model species14. These two tests have also been adapted for use in drug screening assays and have shown promise for identifying novel compounds that modulate social behavior15,16.
In general, behavioral assays in adult zebrafish are powerful tools that can provide valuable information on the behavior mechanisms or the neurophenotypes of active compounds and abused drugs17. This protocol details how to implement these behavioral tools7 with basic material resources and how to apply them in toxicity assays to characterize the effects of a wide range of neuroactive compounds. In addition, we will see that the same tests can be applied to assess the neurobehavioral effects of acute exposure to a neuroactive compound (methamphetamine) but also to characterize these effects after chronic exposure to environmental concentrations of a pesticide (glyphosate).

作者聚焦：成年斑马鱼环境和药物诱导的行为变化评估 

在单个水箱中使用一系列行为测试对成年 Danio rerio 进行神经毒性评估

Our main research aims to identify the behavioral effects induced by environmental pollutants and drugs in fish. Also trying to understand the mechanisms leading to these effects. A social and anxiety-like behavior cannot be conveniently addressed using embryos.We conduct studies targeting these behaviors in the adult Zebrafish model. This protocol details how to implement behavioral tools with basic material resources to facilitate the reproducibility of tests and harmonize the results obtained within the scientific community. The assays presented in this protocol have proven to be highly reproducible and sensitive to genetic and pharmacological manipulations, making them variable and noninvasive tools fostering the neural and molecular mechanisms underlying behavior.Once a behavioral effort has been identified, the most challenging part is to determine the specific modes of action leading to the observative efforts. Starting by the molecular initiating event where predictions can provide some clues on the molecular initiating event, we are still far from obtaining accurate predictions. We are currently interested in the determining the phase validity of the chemical models of Parkinson's disease developed in embryonic and adult Zebrafish by using MPTP and rotenone with the same, the kinematic of the gait-like movement or during an explosive movement like the acoustic evoked escape response, will be evaluated.

在本节中，我们将研究这些行为工具在鱼类神经毒理学中的一些可能应用。以下结果对应于甲基苯丙胺（METH）的急性或暴饮暴食效应（一种娱乐性药物）的特征，以及草甘膦（水生生态系统中发现的主要除草剂之一）的亚慢性效应。
成年斑马鱼甲基苯丙胺暴饮暴食神经毒性模型的表征 在评估 40 mg/L METH 对 NTT 的影响（图 3）时，Kruskal-Walli...

Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Environmental and Drug-Induced Behavioral Changes in Adult Zebrafish at JoVE.com

在这里，我们提出了一个全面的行为测试电池，包括新型水箱、浅滩和社会偏好测试，以有效确定使用单个水箱的化学物质（例如甲基苯丙胺和草甘膦）对成年斑马鱼的潜在神经毒性作用。这种方法与神经毒性和环境研究有关。

The presence of neuropathological effects proved to be, for many years, the main endpoint for assessing the neurotoxicity of a chemical substance. ...

我们的主要研究旨在确定环境污染物和药物对鱼类的行为影响。还试图了解导致这些影响的机制。社交和类似焦虑的行为不能方便地使用胚胎来解决。我们在成年斑马鱼模型中针对这些行为进行研究。该协议详细说明了如何实施具有基本物质资源的行为工具，以促进测试的可重复性并协调在科学界获得的结果。该协议中提出的测定已被证明具有高度可重复性，并且对遗传和药理学操作敏感，使其成为促进行为背后的神经和分子机制的可变和非侵入性工具。一旦确定了行为努力，最具挑战性的部分是确定导致观察努力的具体行动模式。从分子起始事件开始，预测可以为分子起始事件提供一些线索，我们离获得准确的预测还很遥远。我们目前感兴趣的是通过使用 MPTP 和鱼藤酮来确定在胚胎和成年斑马鱼中开发的帕金森病化学模型的相位有效性，步态样运动或在声学诱发逃逸反应等爆炸性运动期间的运动学将被评估。

neurotoxicity-assessment-adult-danio-rerio-using-battery-behavioral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurotoxicity Assessment in Adult Danio rerio using a Battery of Behavioral Tests in a Single Tank

1.1K 次观看.  Institute for Environmental Assessment and Water Research (IDAEA-CSIC). 我们的主要研究旨在确定环境污染物和药物对鱼类的行为影响。还试图了解导致这些影响的机制。社交和类似焦虑的行为不能方便地使用胚胎来解决。我们在成年斑马鱼模型中针对这些行为进行研究。该协议详细说明了如何实施具有基本物质资源的行为工具，以促进测试的可重复性并协调在科学界获得的结果。该协议中提出的测定已被证明具有高度可重复性，并且对遗?...

视频: 作者聚焦：成年斑马鱼环境和药物诱导的行为变化评估 

The presence of neuropathological effects proved to be, for many years, the main endpoint for assessing the neurotoxicity of a chemical substance. However, in the last 50 years, the effects of chemicals on the behavior of model species have been actively investigated. Progressively, behavioral endpoints were incorporated into neurotoxicological screening protocols, and these functional outcomes are now routinely used to identify and determine the potential neurotoxicity of chemicals. Behavioral assays in adult zebrafish provide a standardized and reliable means to study a wide range of behaviors, including anxiety, social interaction, learning, memory, and addiction. Behavioral assays in adult zebrafish typically involve placing the fish in an experimental arena and recording and analyzing their behavior using video tracking software. Fish can be exposed to various stimuli, and their behavior can be quantified using a variety of metrics. The novel tank test is one of the most accepted and widely used tests to study anxiety-like behavior in fish. The shoaling and social preference tests are useful in studying the social behavior of zebrafish. This assay is particularly interesting since the behavior of the entire shoal is studied. These assays have proven to be highly reproducible and sensitive to pharmacological and genetic manipulations, making them valuable tools for studying the neural circuits and molecular mechanisms underlying behavior. Additionally, these assays can be used in drug screening to identify compounds that may be potential modulators of behavior.
We will show in this work how to apply behavioral tools in fish neurotoxicology, analyzing the effect of methamphetamine, a recreational drug, and glyphosate, an environmental pollutant. The results demonstrate the significant contribution of behavioral assays in adult zebrafish to the understanding of the neurotoxicological effects of environmental pollutants and drugs, in addition to providing insights into the molecular mechanisms that may alter neuronal function.

Here, we present a comprehensive behavioral test battery, including the novel tank, Shoaling, and social preference tests, to effectively determine the potential neurotoxic effects of chemicals (e.g., methamphetamine and glyphosate) on adult zebrafish using a single tank. This method is relevant to neurotoxicity and environmental research.

科研

神经科学

Experimental Tank Configuration and Video Recording Setup for Behavioral Testing in Adult Zebrafish

To begin, assemble the square experimental tanks, cameras, and computers. For individual behavior assays of zebra fish. Fill the tank with seven liters of 28 degrees Celsius well-oxygenated fish water.Adjust the position of the tank in front of the camera to avoid distorted images. Using the LED backlight, check the illumination setup, and turn on the camera. Next, open the camera manager to check the availability of the jiggy camera on the computer.Launch the jiggy camera controlling software and open the Camera option. Then select Monochrome Mode and adjust the image size. Open camera properties, and under Camera, set the pixel clock to maximum and frame rate to 30 frames per second.Then, adjust the exposure. Now under Image, set the gain to zero and adjust the black levels. In the Size tab, adjust the window dimensions to the region requiring engraving.Once done, close the camera properties. Next, create a general folder for the experiment session to save the camera settings and videos. Then click File, Save Parameters, and to file to save the settings.After configuring all cameras, open record video sequence and select Create to save as a new video file. Select max frames, and enter 10, 800 in the frame box. Then select Calculate Frame Rate.Introduce the fish one by one at the bottom of the experimental tanks for behavioral tests, and click Record to start the recording. For the shoaling test, introduce the shoal at the bottom of the experimental tank. For the social preference test, introduce the fish one by one at the bottom of the different experimental tanks.Once a chat box with a maximum number of frames achieved appears on the screen, click Accept. Then select Close to conclude the recording. Finally, remove the fish recorded for behavioral tests from the experimental tank and separate them from naive fish.

用于成年斑马鱼行为测试的实验水箱配置和视频记录设置

Analysis of Recorded Videos for Behavioral Testing of Adult Zebrafish

Open the Analysis Software for examining fish behavioral test data. To elaborate on a new template, click on New from template, then Apply a pre-defined template followed by From video file. Then select a video from the template set up.In the Parameters window, select the model fish to adult zebrafish, the arena to Open field, square to one arena and the number of subjects per arena. Then choose the type of detection by Center point and adjust the frame rate to 30 FPS. Name the experiment as a template and store it in the same folder as the rest of the videos.Under Experiment Settings, review the configured setup. In Arena Settings, right click on the center of the screen and select Grab. From file in the display, select a good quality video image and click Accept to capture this image for the background settings.Using the 19 centimeters width of the tank as a scale, calibrate the captured image to create a calibrated rule. Then draw the arena, and using the frame function, delineate the shape zones. For the novel tank test and shoaling test, draw two equal horizontal boxes on the tank.Draw three equal vertical boxes for the social preference test. Under Trial Control Settings, put an infinite time condition and remove the other components. Next, under Detection Settings, select the video for analysis from the video file and check the detection quality.Click on Auto Detect to adjust the detection and refocus the animal. Under Trial Settings, input one trial. Then under Data Profiles, create results dialogue windows.And under Analyze Profiles, select the parameters to analyze. To copy and use the template, open the template file with behavior analysis software. Then go to File and click Save As to create a new identical file.Alternatively, select New from Template, then apply to custom template. Next, go to Arena Settings to readjust the template. Under Acquisition, select DDS, then click Ready to start to process the video.Once the acquisition is complete, go to track editor to check the processed video. Finally, in Statistics, click on Calculate, then Export Data. Anxiety behavior assessed in a novel tank test of zebrafish exposed to methamphetamine exhibited a decrease in distance traveled, exploration distance and time, and number of visits to the upper zone of the tank.The latency time before the first visit to the upper zone increased significantly. Freezing behavior increased also significantly after three hours of methamphetamine exposure. Social behavior assessed in the shoaling test of the methamphetamine treated fish displayed a behavioral phenotype of social isolation with an increased average and farthest distances between individuals.Social behavior assessed in the social preference test of the methamphetamine treated fish showed a significant decrease in time spent and distance traveled in the conspecific zone.