6-羟基多巴胺诱导的基于斑马鱼的成人帕金森病模型的运动评估

该方案在显示斑马鱼运动障碍和随后在腹侧间脑室注射神经毒素 6-羟基多巴胺后恢复方面具有重要意义。该技术展示了功能效应的变化，这对应于使用非常简单的设置的6-OHDA病变的成年斑马鱼腹侧间脑中多巴胺能神经元的特定消融。未来对神经再生机制的研究，以及调节该过程的内在和外在因素，可能为针对帕金森病的细胞替代治疗策略提供重要的见解。

将鱼保持在充气蒸馏矿化水箱中，每升商业海盐一克，控制温度为28，加或减一摄氏度。每45升水箱最多容纳25条鱼，并将它们暴露在14小时的光线和10小时的黑暗光周期中。每天至少用食物颗粒喂鱼两次，并辅以冻干的蠕虫。

通过将两克半的三卡因甲磺酸盐和五克碳酸氢钠溶解在250毫升蒸馏水中，制备三卡因甲磺酸盐的储备溶液。稀释两毫升储备溶液，制成200毫升工作麻醉溶液。新鲜制备99.96毫摩尔6-羟基多巴胺，首先将0.2毫克抗坏血酸溶解在一毫升0.9%重量%的无菌过滤氯化钠中。

用0.2微米过滤器过滤溶液。然后将25毫克粉末形式的6-羟基多巴胺加入溶液中。将麻醉的鱼放在水浸泡的海绵上，置于体视显微镜下，并定期弄湿鱼。

根据介位缝合线，冠状缝合线和矢状缝合线之间的交集，确定注射的位置，连接斑马鱼大脑的顶骨和额骨。然后用锋利的27号针做一个一毫米见方的小孔。以60度角降低微毛细血管注射器，直到它到达距离斑马鱼头骨颅顶1200微米的深度。

按 Z 轴限制以固定位置。将初始注射压力设置为 4， 000 百帕斯卡。注射持续时间为2.3秒。

补偿压力至10百帕。降低注射强度，每次后续注射。在假对照组中注射0.5微升99.96毫摩尔神经毒素6-羟基多巴胺或0.9%重量体积盐水，并让微毛细血管休息20秒。

在整个过程中继续用蒸馏水润湿鱼，以防止干燥。慢慢取出微毛细血管，在流动的蒸馏水中复苏鱼。将鱼放在一个隔离的回收池中，并清除任何可能干扰恢复过程的干扰。

在下一次注射前冲洗微毛细管，以清除堵塞并确保注射强度足以产生所需体积的0.5微升6-羟基多巴胺。在第3天和第30天，在6-羟基多巴胺之后，通过开放水箱测试单独对斑马鱼进行运动评估。将壁上覆盖着白纸的实验罐放在凸起的平台上。

使用光源从底部照亮水箱。用80%至90%的蒸馏水填充罐，并将温度保持在28，正负一摄氏度。使用温度计测量温度，并使用商用水族箱加热器进行调节。

经过至少两分钟的适应后，使用摄像机在实验区域的二维平面上从计划视图记录鱼的游泳行为五分钟。为避免不一致，在不同批次的录音中，适应时间不超过10分钟。使用具有开放坦克协议的视频跟踪软件分析视频，以获取每个受试者的行进距离和平均速度。

本实验评估了6-羟基多巴胺脑室内显微注射后成年斑马鱼游泳行为的变化。感兴趣的主要大脑区域是腹侧间脑，由视前区，后结核和下丘脑组成。腹侧间脑中超过85%的酪氨酸羟化酶免疫反应性多巴胺能神经元在病后第三天被消融。

酪氨酸羟化酶免疫反应性多巴胺生成神经元的数量在病程后第14天增加50%以上，然后在病程后30天实现完全再生。使用视频跟踪软件对斑马鱼游泳行为的分析表明，与假的相比，病变组在后三天的平均速度和行进距离显着降低到不到45%。病变组在病程后30天表现出运动功能恢复，与假组相比，平均速度或行进距离没有显着差异。

在固定的时间范围内进行运动评估非常重要。例如，上午 8:00 到中午 12:00。并且整个实验过程中的水温保持在28摄氏度。可以进行其他行为测试，如浅滩和焦虑样行为，以探索在成年斑马鱼大脑注射6-OHDA后多巴胺能神经元消融的其他变化或功能效应。