作者感谢 Amanda Franscisco、John Kelly 和 Fanny Escudié 提供药物疗效测定的 BLI 培训和支持，感谢 John Kelly 和 Simone Calderano 提供寄生虫，感谢 Gabriel Padilla 对动物研究的支持。A.C.S 获得了 CAPES PSDE 奖学金，在伦敦卫生和热带医学学院（英国）接受培训。作者还要感谢圣保罗大学科学研究核心设施 （CEFAP-USP） 的流式细胞术和成像研究 （FLUIR） 平台为 IVIS 光谱设备分析提供的技术支持，以及遗传学和卫生控制实验室 ICB-USP 为小鼠进行无特定病原体质量控制的实验后测定。该项目由 DNDi 资助。DNDi 感谢其公共和私人捐助者，自 2003 年成立以来，他们为所有 DNDi 活动提供了资金。DNDi 捐助者的完整名单可在 https://dndi.org/about/donors/ 上找到。

查加斯病药物评估的体内生物发光模型方案

作者无需声明利益冲突。

生物发光成像是一种突破性的方法，它允许使用可见光和红外电磁辐射光谱来检测报告基因。因此，无需使用放射性标记物来追踪您的标本35。BLI 适用于啮齿动物模型和其他小型物种。它对临床前研究非常有用，因为它更安全，并且允许多次成像，从而最大限度地减少动物不适。此外， 由于 可以结合生物发光、荧光和其他技术（如正电子发射断层扫描）36，因此体内成像非常灵活。
光学成像受光学物理特性（如吸收和散射）的约束。所有组织吸收和散射不同波长的光的方式不同37.一个关键步骤是选择报告基因，而不考虑化学反应产生的光的发射波长。虽然在生物发光测定中，报告基因表达水平在体外可能很高，但在进行到体内设置时可能无法达到相同的表达水平。在该方案中，我们使用了红移 Photinus pyralis 荧光素酶 （PpyRE9H）38 密码子优化版本用于锥虫9，它在 617 nm 处发光，是最适合体内研究的化合物之一39。波长超过 600 nm 的发色团较少被人体内源性发色团吸收和散射，尤其是血红蛋白和黑色素。因此，红光可以穿过几厘米的组织，使光子甚至可以从内脏组织内部到达 CCD 相机39,40。
成像设置中令人担忧的一个领域是缺乏对其功能和效果的全面了解。像素合并是一种预处理技术，可将连续检测器获取的信息组合成一个更大的像素。此过程增强了信噪比，降低了背景噪声并提高了灵敏度。但是，它会降低空间分辨率精度，导致图像像素化41,42。这种权衡是成像策略中的一个重要考虑因素。
基于美洲锥虫病34 的目标产品概况和目标候选药物概况，概念验证研究侧重于检测 克氏锥虫 的敏感性，并帮助确定新的候选药物是否可以实现无菌治愈（表现为在几轮免疫抑制后没有复发）。因此，我们使用最高的像素合并因子来执行 BLI，而不会使图像过度饱和。当图像超饱和时，使用较低的像素合并因子执行新的采集。在分析过程中，将对需要不同像素合并的图像进行数学校正。这样，最终数据应使用相同的分箱表示。 表 1 显示了在同一图像和 ROI 中应用不同的合并因子时获得的不同值。
表 1：分箱设置对 BLI 定量的影响。 急性模型 （d13） 和慢性模型 （d118） 图像的三个 ROI 的量化，在不同的分箱因子中进行分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/DaSilvaetal_Table1_Reviewed.xlsx" target="_blank">请点击此处下载此表格。</a>
由于目前临床上存在美洲锥虫病的情况，药物发现工作旨在完全消除寄生虫（寄生虫学治愈）27,34。因此，体内临床前方案包括克服 BLI 技术敏感性局限性的方法。其中一种方法是用环磷酰胺治疗小鼠，以减少控制寄生虫负荷的免疫反应。另一种策略是减少组织深度并去除阻碍光线通向相机的肌肉、皮肤和毛皮层。通过离体程序，可以检测到小的生物发光点，显示寄生虫病灶低于体内 BLI 阈值，如图 5C 所示，由 Posa 处理的小鼠的离体结果。
设计一个试点实验来评估模型本身和感染动力学对于建立准确的抗寄生虫药物疗效评估实验至关重要。因此，研究人员将能够提前定义适当的 BLI 设置和感染时间过程。在探索性实验中，一种有助于定义采集设置的工具是“Autoexposure”。使用此工具，研究人员可以确定三个设置（曝光时间、 像素合并和 F/Stop）的优先级，以获得最佳图像。特别是，研究人员应确保在 CCD 相机的动态范围内采集图像，没有过饱和度或曝光不足，这可以通过刻度的最小和最大限制以及自动曝光功能（菜单 编辑 > 首选项 > 选项卡采集 > 选项卡自动曝光).在该协议中，相机光圈设置为最大值（F/Stop：1），并为急性和慢性模型定义了不同的曝光时间和像素合并因子。这些设置提供了时间可预测性，以便同时执行不同的图像轮次。考虑到报告基因方法基于酶促反应，底物在小鼠中的生物分布和荧光素酶动力学都会影响生物发光信号，从而影响感染定量（图 1B）。因此，在酶动力学的不同时刻采集图像会引入无法解释或校正的数据可变性，并影响总通量（光子/秒/cm2/球面度）计算。此外， 克氏锥虫 感染在小鼠中表现出动态的空间定位 （不同的区域和组织、深度和寄生虫负荷）。因此，如果另一个较强信号源满足定义的自动曝光标准，则确定要采集的计数值可能会错过较弱的信号源（组织更深处某个位置的寄生虫数量较少）。
Living Image 软件的一个棘手功能是以自动色标显示采集的图像。没有选项可以预设比例以根据所选的比例值自动显示全新的采集图像（参见协议步骤 6.2）。这种情况迫使研究人员手动将图像逐个更改为所选的最大值和最小值。因此，没有经验且未受过良好培训的用户在采集会话期间无法获得正确的读数，他们可能会误导数据或丢失该时间点的重要信息。为此，试点实验是有益的。
关于概念验证实验设计，最常见的问题之一是如何选择治疗持续时间和剂量。对于新的化学实体，这些参数通常由化合物在体外的效力和选择性，结合药物代谢和药代动力学 （DMPK） 生成的数据以及在体内试验功效之前进行的耐受性研究来确定。总之，在确定能够选择性杀死细胞内寄生虫的化合物后，在体外进行第一次 ADME 实验（吸收、分布、代谢和排泄），以估计化合物的水溶性、细胞通透性和代谢稳定性等参数。如果化合物在体外特性（通常在靶标候选物谱中定义）显示出良好的平衡，那么这些候选物将在健康小鼠中进行体内药代动力学 （PK） 研究，该研究概述了血液（也可能在组织中）中的化合物暴露，并提供了不同剂量水平下耐受性的一般概念17，34,43.理想情况下，大多数传染病的 PK 评估目标是确定达到高于 EC50/EC90 浓度44 的游离血浆浓度（校正血浆蛋白结合）的可行性 - 杀死或至少抑制 50% 或 90% 寄生虫生长的有效浓度，分别 - 足够长的时间。如果在一定剂量水平下实现了足够的暴露，那么这种方案可以在使用 Chagas BLI 模型的疗效研究期间使用。对于药物重新定位研究，应提供体外和体内 PK 数据。药物再分析的一个良好开端是 PubChem45 等化学数据库，它提供公认的数据，这些数据可以使用异速生长缩放46 转换为小鼠，以估计要测试的安全和无毒治疗方案。然而，情况并非总是如此。PK 研究在学术科学中仍然是一个被忽视的领域，很少有制药公司公布他们的 PK 结果。药物发现科学界建议将体内 PK 评估与药物疗效测定（药效学）47 一起包括在内。因此，临床前成像同时与化合物测量兼容，并且这种相关方法增强了数据的稳健性。
此外，在整个实验过程中都会监测小鼠的处理、体重和健康状况。毒性和副作用的迹象，如驼背、颤抖、失去平衡、不愿移动、不愿进食或饮水、虚脱或群体中或个体小鼠状况存在的任何其他异常，应在临床前研究中登记和报告。光学成像的目标之一是确保动物的健康。因此，人道终点应用于具有“鬼脸量表48”中描述的疼痛迹象的小鼠。此外，在 BLI 采集期间每周对小鼠称重，更常见的是在药物给药和 CTX 治疗期间称重。根据动物福利法规，体重减轻超过 20% 的小鼠必须立即进行人道安乐死。
克氏锥虫生物发光模型现在是发现和开发美洲锥虫病新疗法的最先进的实验模型。该模型复制了克氏锥虫感染和美洲锥虫病49 的关键特征，允许实时监测寄生虫血症和区分与已知作用方式相关的具有不同疗效特征的化合物。BLI 是一种增强识别感染组织自信的技术。它能够精确选择感染组织以用于广泛的方法，包括已经应用于克氏锥虫研究的所有经典方法50,51。此外，它还允许研究人员探索尖端技术并开发新技术33。此外，BLI 根据 3Rs 原则10,35 同时改善动物福祉和更合理地使用动物。
几个专注于被忽视的热带病的研究小组被放置在没有活体成像设备的国家。为了克服当前情况，全球生物成像 （Global BioImaging） 及其相关联盟等新的国际网络促进了提供对成像核心设施的开放访问并改善工作人员和成像科学家的培训的行动52,53。这些举措，以及像这样的友好用户协议，可以为所有研究人员提供使高端技术大众化的条件。该方法在临床前药物发现中的实施提供了可靠的疗效读数和临床结果的预测价值，有助于查加斯病的药物发现。

美洲锥虫病在拉丁美洲流行，影响全球约 700 万人1。每年，超过 50,000 人死亡，约 70 亿美元的经济损失是由这种疾病的致残性质造成的2。美洲锥虫病是由原生动物克氏锥虫引起的，这是一种异异型鞭毛寄生虫，能够感染美洲的哺乳动物（野生和家养）和锥蝽媒介（半翅目、Reduviidae）3，并在那里建立了媒介传播。其他重要的感染途径包括输血、器官移植、口服（通过摄入被感染的锥蝽污染的食物）4 和先天性传播。非媒介传播途径导致美洲锥虫病向非流行地区传播 3,5。
美洲锥虫病表现为两个临床阶段。在大多数情况下，急性期无症状。有症状的感染通常与非特异性体征有关，例如发热、疲劳、肌痛、淋巴结肿大、脾肿大和肝肿大。急性期也常与未闭寄生虫血症和寄生虫的全身循环有关。高达 10% 的确诊病例可能发生死亡，尤其是口腔感染6。慢性期通常以长时间没有任何症状为特征。随着时间的推移，大约三分之一的几十年前感染的患者表现出心脏表现，通常伴有纤维化和心肌炎症，和/或胃肠道疾病，主要与巨食管和/或巨结肠综合征的发展有关3,5,6。
恰加斯病的病因治疗仅包括两种药物：苄硝唑和硝呋替莫。这些抗寄生虫药已经上市 50 多年，具有相当大的毒性和有限的疗效 5,7,8。因此，迫切需要为美洲锥虫病患者开发新的、安全的、更有效的治疗方法。
更复杂、更准确的技术现在可以获得老问题的答案，从而在寻找美洲锥虫病的新治疗方法方面取得进展。从这个意义上说，科学界从转基因寄生虫中受益匪浅，用于感染过程的体内研究和药物疗效评估 9,10,11,12。基于生物发光成像 （BLI） 系统的纵向测定允许在治疗方案期间和之后评估疗效，从而鉴定出具有杀锥虫活性的化合物10,13。BLI 方法通过定量转基因克氏毛萤火虫 CL Brener Luc：：Neon 谱系11 产生的光，组成型表达红移萤火虫荧光素酶12，直接测量循环或组织和器官中的寄生虫负荷。
尽管如此，在美洲锥虫病 BLI 动物模型和药物疗效研究建立近 10 年后，只有少数研究小组主导了这项技术。这一事实不仅是由于获得适当成像设备的机会减少，而且缺乏培训和结构化、详细的协议的可用性。与其他方法相比，这种方法具有几个优势，其他方法依赖于通过显微镜、血清学或通过 qPCR 进行器官/组织感染评估来评估寄生虫血症以进行寄生虫 DNA 检测，因为它可以改善小鼠健康状况并减少动物使用，从而有可能在体内产生更强大和综合的数据。此外，这种方法可以说更敏感，因为它能够在药物治疗后随时检测内脏器官中的寄生虫病灶10,12。因此，该协议旨在通过详细说明技术程序来指导寄生虫学和其他传染病的研究小组在其实验室中建立该方法。在这里，我们分享了通过在巴西实施美洲锥虫病 BLI 模型获得的经验，这是拉丁美洲的首个此类模型，这是被忽视疾病药物倡议 （DNDi） 协调的药物发现工作的一部分。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >BD LSRFortessa&#8482; X-20 Cell Analyzer</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Weighing Balance (animal facility)</td>
			<td>Available from several suppliers</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td >Revvity (former PerkinElmer)</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FlowJ Software v10.7.1</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Living Image Software for Spectrum v4.7.1</td>
			<td >Revvity (former PerkinElmer)</td>
			<td ></td>
			<td>License Free Analysis Software called &#39;Aura Imaging&#39; could be used for the most basic features provided by Spectral Instruments Imaging (Bruker company) (https://spectralinvivo.com/software/)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microsoft Office software</td>
			<td >Microsoft</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GraphPad Prism v8.4.0</td>
			<td >GraphPad Software Inc.</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM Low Glucose</td>
			<td>Vitrocell</td>
			<td >D0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td >16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td >15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin 0.5% EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td >25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LIT medium</td>
			<td>In house</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hygromycin B (50 mg/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td >10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grace&#8242;s Insect Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td >G9771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td >54457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IVISBrite d-luciferin potassium salt</td>
			<td>Revvity (former PerkinElmer)</td>
			<td >122799</td>
			<td>Also could be used: VivoGlo Luciferin, in vivo grade (Promega/P1043); D-Luciferin, Monopotassium Salt (Thermo Scientific/88293) or PierceD-Luciferin, Monosodium* Salt (Thermo Scientific/88291); D-Luciferin, Potassium Salt (GoldBio/LUCK or eLUCK); D-Luciferin, Sodium* Salt (GoldBio/LUCNA or eLUCNA) *Sodium or potassium salt differences relies minimal chances on solubility, however do not affect in vivo performance.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td >21600-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cyclophosphamide (CTX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >C0768-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >(Hydroxypropyl)methyl cellulose (HPMC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >09963-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Benzyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >402834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tween 80</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td >P1754-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Benznidazole</td>
			<td>ELEA</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Posaconazole (Noxafil commercial formulation)</td>
			<td>Schering-Phough</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Giemsa</td>
			<td>Available from several suppliers</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >gavage needle (stainless-steel straight) - 22GA</td>
			<td>Aton</td>
			<td >&#160;CA2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 mL Syringe and 31G needle</td>
			<td>Available from several suppliers</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 mL Syringe and removable 26G needle</td>
			<td>Available from several suppliers</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 mL Syringe and removable 24G X&#190; needle</td>
			<td>Available from several suppliers</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile Syringe Filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Available from several suppliers</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A4 Matte Black paper 120gr or thicker</td>
			<td>Paper Color/ Canson (Available from several suppliers)</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >aluminum foil</td>
			<td>Available from several suppliers</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neubauer chamber</td>
			<td>Available from several suppliers</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demystifying in vivo bioluminescence imaging of a chagas disease mouse model for drug efficacy studies

为了控制和减少美洲锥虫病、利什曼病和非洲人类锥虫病等人类原生动物疾病对公共卫生的影响，有必要加快新药和疫苗的开发。然而，这个过程充满了困难，例如高度复杂的寄生虫生物学和疾病发病机制，并且与被忽视的热带病一样，研发资金相对有限。因此，能够充分再现感染和疾病关键特征同时提供合理利用资源的 体外 和 体内 研究模型对于推进这些疾病的研究至关重要。一个例子是用于美洲锥虫病的 体内 生物发光成像 （BLI） 小鼠模型，该模型可对表达荧光素酶的克 氏锥 虫寄生虫产生的长波长光进行高灵敏度检测。尽管这项技术已成为 体内药物疗效 研究的标准方法，但由于缺乏关于设备处理和质量控制程序应用的适当实践培训，即使合适的 BLI 设备随时可用，研究小组也可能难以实施它。考虑到这种情况，该协议旨在指导从规划实验到数据采集和分析，其细节有助于在对 BLI 经验很少或没有经验的研究小组中实施协议，无论是针对美洲锥虫病还是其他传染病小鼠模型。

Chagas disease is endemic in Latin America and affects approximately seven million people worldwide1. Annually, more than 50,000 deaths and economic losses of around 7 billion dollars&#160;result from the disabling nature of this disease2. Chagas disease is caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, a heteroxenic hemoflagellate parasite capable of infecting mammals (wild and domestic) and triatomine vectors (Hemiptera, Reduviidae)3 in the Americas, where the vectorial transmission is established. Other important infection routes include blood transfusion, organ transplantation, oral (by the ingestion of food contaminated with an infected triatomine)4, and congenital transmission. Non-vectorial transmission routes have contributed to the spread of Chagas disease to non-endemic areas3,5.
Chagas disease manifests in two clinical phases. The acute phase is, in most cases, asymptomatic. Symptomatic infections are usually associated with non-specific signs such as fever, fatigue, myalgia, lymphadenopathy, splenomegaly, and hepatomegaly. The acute phase is also often associated with patent parasitemia and systemic circulation of parasites. Death may occur in up to 10% of the diagnosed cases, especially in those of oral infection6. The chronic phase is often characterized by a long period of absence of any symptoms. With time, approximately one-third of the patients infected decades earlier exhibit cardiac manifestations, usually accompanied by fibrosis and myocardial inflammation, and/or gastrointestinal disorders mostly related to the development of megaesophagus and/or megacolon syndromes3,5,6.
The etiological treatment of Chagas disease consists of only two drugs: benznidazole and nifurtimox. These antiparasitic agents have been available for over 50 years and have considerable toxicity and limited efficacy5,7,8. Consequently, there is a pressing need to develop new, safe, and more efficacious treatments for Chagas disease patients.
More sophisticated and accurate techniques make it possible now to obtain answers to old questions that allow advances in the search for new treatments for Chagas disease. In this sense, the scientific community greatly benefits from genetically modified parasites for in vivo studies on the course of infection and evaluation of drug efficacy9,10,11,12. A longitudinal assay based on the bioluminescence imaging (BLI) system allows efficacy evaluation during and after the treatment regimen, leading to the identification of compounds with trypanocidal activity10,13. The BLI method provides a direct measurement of parasite load, both in circulation or in tissues and organs, through the quantitation of light produced by the genetically modified T. cruzi CL Brener Luc::Neon lineage11, which constitutively expresses the red-shifted firefly luciferase12.
Nonetheless, nearly 10 years after the establishment of the Chagas disease BLI animal model and drug efficacy studies, only a few research groups dominate this technique. This fact is due to not only the reduced access to proper imaging equipment but also the lack of training and availability of structured, detailed protocols. This method presents several advantages over other approaches, which rely on the assessment of parasitemia by microscopy, serology, or organ/tissue infection evaluation by qPCR for parasite DNA detection, as it allows improved mice well-being and reduction of animal use by the possibility of generation of more robust and integrated data in vivo. Furthermore, this method is, arguably, more sensitive, as it enables ready detection of parasite foci in visceral organs after drug treatment10,12. Therefore, this protocol aims to guide research groups on Parasitology and other infectious diseases to establish this methodology in their laboratories by detailing the technical procedures. Here, we share the experience obtained through implementing of the Chagas disease BLI model in Brazil, the first of its kind in Latin America, as part of the drug discovery efforts coordinated by the Drugs for Neglected Diseases initiative (DNDi).

作者聚焦：实时监测寄生虫负荷和宿主反应

揭开查加斯病小鼠模型的体内生物发光成像的神秘面纱，用于药物疗效研究

Our research group works in drug discovery for Chagas disease. We are searching for new and better drugs, and also trying to understand how the parasite, Trypanosoma cruzi, can persist in the host and survive even after efficacious drug treatment without developing drug resistance. Chagas disease is a complex systemic infection that requires parasitological cure to be treated with success before the onset of the complicated disease.The disease manifests in different forms in humans, but animal models cannot yet reproduce all important aspects of the disease. Ideally, new antiparasitic drugs for Chagas disease should promote parasitological cure, meaning the eradication of Trypanosoma cruzi parasites from the host. These protocols allows the realtime tracking of parasite burden in mice, and to differentiate compounds that only transiently suppress the parasitemia from those that can promote parasitological cure.This protocol allows for noninvasive reduced animal use and monitoring of mice during both acute and chronic infection, and also enables for monitoring of visceral infection in real time. Using a similar protocol, we are developing new methods for understanding how drug therapy may benefit the host by preventing the onset and treating complicated Chagas disease. We will also continue to do research on the factors involving Trypanosoma cruzi evasion of drug treatment.

使用基于组成型表达荧光素酶的转基因寄生虫的适当小鼠模型，可以复制对宿主造成最小伤害的关键人类克 氏锥虫 感染特征，从而允许通过宿主的全身 BLI 以纵向（终生）方式实时跟踪寄生虫，长达数月12。
图 3 显示了 BALB/c 小鼠从感染后第 1 天到 150 dpi 的 CL Brener Luc：：Neon 感染时间进程。在前 20 dpi 中，生物发光推断的寄生虫负荷增加，典型的寄生虫血症峰值，随后由于小鼠免疫控制，寄生虫负荷急剧下降。因此，感染的急性期被认为是前 50 dpi。当感染达到 100-150 dpi 的恒定生物发光速率时，即定义为慢性期。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66740/66740fig03v2.jpg"> 图 3：了解模型。 BALB/c 小鼠 CL Brener Luc：：Neon 感染的动力学 （n = 11）。上图：通过腹膜内注射 1 x 10³ 血流锥鞭毛体感染后 150 天 （dpi） 来自不同时间点的腹侧和背侧生物发光图像。辐射中生物发光信号的热图比例（在 Log10 中）（p/s/cm2/sr）。颜色代码：紫色 = 5 x 103;红色 = 1 x 107.下图：全身小鼠总通量 （p/s） 中的生物发光信号定量。数据表示为均值 （线条） 和标准差 （阴影区域）。在该小鼠模型中为感染的急性和慢性期定义的时期以橙色突出显示。未感染小鼠的发光平均值 （n = 3） 显示为阈值（浅灰线）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/66740fig03large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
治疗结果也可以预测，因为感染的主要阶段在小鼠模型中得到了很好的再现。因此，BLI 现在通过概念验证研究应用于转化科学，这些研究支持有关化合物疗效潜力和开发管道进展的决策10,27。在急性小鼠模型中，当感染达到寄生虫血症高峰（约 14-21 dpi）时应开始口服治疗，其特征是血液中大量锥鞭毛体（约 1 x 105 个锥鞭毛体/mL - 数据未显示）和全身感染。在慢性期，小鼠治疗从 100 dpi 开始，此时寄生虫负荷相对较低，亚专利寄生虫血症稳定。
为了证明上述方案在抗寄生虫药评估中的应用，我们比较了用于治疗查加斯病的标准药物苄硝唑 （BZ） 和泊沙康唑 （Posa） 的治疗效果，泊沙康唑 （Posa） 是一种甾醇 14α-脱甲基酶 （CYP51） 抑制剂，在查加斯病的临床试验中失败，并且也被证明在体外和体内作为抗克氏锥虫的抗寄生虫剂无效，包括本协议中描述的 BLI 模型 13,18,28,29,30。
对于急性小鼠模型，每组 6 只小鼠通过管饲法31 口服治疗 20 天，用 20 mg/kg 的 Posa 或 100 mg/kg 的 BZ，每天一次。小鼠也用 BZ 以 100 mg/kg 每天一次治疗 5 天，以评估短期治疗的效果。化合物消除后（治疗结束后 10 天），BLI 阴性小鼠受到免疫抑制，当未实现寄生虫学治愈时，这种情况会促进感染复发（图 4A）。Posa 处理导致治疗结束时生物发光推断的寄生虫负荷减少了 99.49% ± 0.27%（平均值±标准差），并且在药物化合物消除期间保持与未感染小鼠的相似水平（小鼠 #3 除外，在 40 dpi 时具有瞬态信号，小鼠 #2 在 44 dpi 时表现出较弱的 BLI 斑点）。与未治疗组相比，BZ 治疗 20 天后，治疗结束时生物发光推断的寄生虫负荷降低了 100% ± 0.01%。相比之下，用 BZ 短期处理 5 天导致 99.98% ± 0.03 dpi 时减少 19%（类似于阈值水平）。然而，在这种情况下，BLI 降低是短暂的，并且在随后的采集中，所有小鼠都表现出感染再激活（图 4B）。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66740/66740fig04v3.jpg"> 图 4：在恰加斯病急性模型中使用生物发光成像获得的概念验证实验设计和结果。（A） 急性恰加斯病小鼠模型中用于化合物疗效评估临床前研究的时间线过程示意图。黑点：成像时间点。药瓶和橙色条：分别是治疗开始和结束。注射器图标：环磷酰胺注射液。DPI：感染后 dI。颜色代码：灰色 = 未经治疗的感染;橙色 = 治疗期;蓝色 = 化合物消除阶段;黄色 = 免疫抑制期。（B） 克氏锥虫的治疗时间进程。左图：BALB/c 小鼠的腹侧生物发光图像 （i） 未处理或处理 20 天，（ii） 20 mg/kg 的泊沙康唑 （Posa），（iii） 100 mg/kg 的苄硝唑 （BZ） 处理 20 天，以及 （iv） 100 mg/kg 的 BZ 处理 5 天，（n = 6/组）。所有治疗均通过管饲法 （10 mL/kg） 口服给药，每天一次。Log10 比例热图表示生物发光信号强度，从低水平（蓝色）到高（红色）。右图：生物发光成像数据的全身量化。数据表示为均值 （线条） 和标准差 （阴影区域）。关键：药瓶：治疗开始 （14 dpi）;橙色条：治疗结束 （18 dpi/33 dpi）;注射器 ICON 环磷酰胺注射液（从第 44-53 天开始）;橙点：通过离体程序分析的小鼠;§ 由于尿液中 D-荧光素渗漏而排除的数据。（C） 器官和组织中克氏锥虫病灶检测的离体程序。板分布键显示在图的底部 （使用 BioRender.com 创建：ZY26LG8AOF）。与 vivo 面板中所示的辐射度刻度相同。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/66740fig04largev2.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
在该模型中，抗寄生虫治疗可能会将寄生虫载量降低到 1000 个寄生虫的 BLI 检测限以下。因此，小鼠表现为 BLI 阴性10。为了确保实现寄生虫学治愈，有必要使用环磷酰胺治疗促进小鼠的免疫抑制29,32。药物治疗后仍具有检测不到寄生虫负荷的小鼠在免疫抑制后会变为 BLI 阳性。这种效果在急性模型中的 Posa 治疗中得到了更广泛的体现，它促进了寄生虫的复发。在该实验中，对生物发光信号最低的小鼠进行 ex vivo 程序，以评估寄生虫组织嗜性（图 4C）。未经治疗的小鼠显示出强烈的生物发光信号，尤其是在胃肠道 （TGI） 和相关组织（如内脏脂肪和肠系膜）中。此外，皮肤是与寄生虫持久性相关的部位。用 Posa 处理的小鼠呈现强度较低的生物发光斑点，这些斑点更局限于结肠、肠系膜和内脏脂肪。另一方面，在用根治性治疗方案治疗的小鼠中，作为 BZ 100 mg/kg 持续 20 天，即使在免疫抑制下也没有检测到生物发光信号。因此，考虑到在促进生物发光信号上升到 1000 个寄生虫10 的阈值水平以上，并通过暴露内脏器官提高敏感性后，认为 BZ 100 mg/kg 持续 20 天提供无菌治愈。无菌治愈的评估先前已通过不同的技术验证10、13、17、33、34。
类似的研究设计应用于慢性模型（图 5A），其中小鼠 （n = 6/组） 在感染后第 100 天开始接受治疗。此时，口服 Posa 20 mg/kg、100 mg/kg 的 BZ 或 10 mg/kg，每天一次，持续 20 天。药物消除期后，BLI 阴性小鼠受到免疫抑制。此外，为了评估无菌治愈，对免疫抑制阶段结束时仍为 BLI 阴性的小鼠进行 离体 分析。
在慢性感染中，用 20 mg/kg 的 Posa 处理导致治疗结束时生物发光推断的寄生虫负荷降低 95.03% ± 6.18%，并且在药物消除期间保持在与未感染小鼠相似的水平。免疫抑制后，大多数小鼠表现出不同水平的 BLI 信号和分布（图 5B）。 离体 程序显示，一只用 Posa 治疗的全身 BLI 阴性小鼠在结肠中有一个生物发光点，可通过 离体 检查检测到（图 5C）。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66740/66740fig05v3.jpg"> 图 5：通过生物发光成像在克氏锥虫感染慢性模型中获得的药物评估实验设计和结果。 （A） 慢性恰加斯病小鼠模型的实验设计示意图。黑点：成像时间点。药瓶和橙色条：分别是治疗开始和结束。注射器图标：环磷酰胺注射液。Dpi：感染后 dI。颜色代码：灰色 = 未经治疗的感染;橙色 = 治疗期;蓝色 = 化合物消除阶段;黄色 = 免疫抑制;淡紫色 = 复发。（B） 美洲锥虫病慢性模型中治疗效果的纵向评价。左图：BALB/c 小鼠的腹侧 BLI （i） 未处理或用 （ii） 泊沙康唑 （Posa） 以 20 mg/kg 的剂量处理 20 天;（iii） 苄硝唑 （BZ） 为 100 mg/kg，和 （iv） BZ 为 10 mg/kg（n = 6/组）。所有治疗均通过管饲法口服给药，每天一次。右图：腹侧和背侧总通量原始数据的总和。关键：药瓶：治疗开始 （102 dpi）;橙色条：治疗结束 （121 dpi）;黄色条和注射器图标：环磷酰胺注射（从第 131-142 天开始）。橙点：通过离体程序分析的小鼠。!小鼠在麻醉期间死亡。<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66740/66740eq01.jpg" style="margin: auto;">小鼠显示腹部异常。热图比例 （Log10） 以辐射单位表示生物发光强度，从低水平（3 × 105 为蓝色）到高（1 × 107 为红色）。（C） 组织中克氏锥虫嗜性的离体分析。用 100 mg/kg 的 Posa 和 BZ 处理后免疫抑制的体内 BLI 阴性小鼠或未处理组和 BZ 为 10 mg/kg 组中信号最低的小鼠的切除器官的生物发光检测。板分布键显示在图的底部（使用 BioRender.com：ZY26LG8AOF 创建）。辐射度标度等于体内面板。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/66740fig05largev2.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
用 100 mg/kg 的 BZ 处理在 122 dpi 时将生物发光降低到阈值水平 （93.87% ± 2.14%），并向前直到实验结束。考虑到 离体 分析，BZ 实现了 100% 的治愈率 （6/6 只小鼠），因为即使检查免疫抑制和内部器官，也没有小鼠出现生物发光信号的恢复。这意味着没有复发。尽管如此，较低浓度的 BZ 治疗方案导致生物发光略有降低 （85.95% ± 18.43%）但没有治愈，因为小鼠在所有后续时间点继续显示可检测的生物发光信号焦点。因此，该模型允许定量区分无效治疗（泊沙康唑和苄硝唑次优治疗）和有效治疗（苄硝唑的最佳剂量和治疗时间）。
补充图 1：通过测量报告基因 mNeonGreen 荧光对 克氏锥虫 群体荧光素酶表达进行感染前分析。 由 CL Brener Luc：：Neon 寄生虫组成型表达的 mNeonGreen 荧光蛋白的流式细胞术。通过 mNeonGreen 荧光强度（X 轴）绘制寄生虫数量（Y 轴）的归一化直方图。内部图例显示了分析的菌株和形式、荧光中位数和荧光群的百分比。门系由 CL Brener 野生型 （WT） 菌株定义为非荧光对照。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/daSilvaetal_Supplemental_Figure%201.zip" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充表 1：BLI 测量中的分析表示例。 从急性模型感染后第 19 天的生物发光成像定量中获得的原始数据，如图 4B 所示的代表性结果。组描述：作为未感染的小鼠对照（n = 3 /组）;载体作为未经治疗的感染小鼠;泊沙康唑 （Posa） 20 mg/kg，持续 20 天;苄硝唑 （BZ） 100 mg/kg，持续 20 天;100 mg/kg 的 BZ 处理 5 天 （n = 6/组）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/daSilvaetal_Supplemental_Table1.zip" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>

此处提供的方案描述了在 克氏锥虫 感染的生物发光模型中进行药物疗效研究的详细步骤，重点是数据采集、分析和解释。此外，还提供了故障排除和质量控制程序，以最大限度地减少技术问题。

To control and decrease the public health impact of human protozoan diseases such as Chagas disease, leishmaniasis, and human African trypanosomiasis, ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Demystifying In Vivo Bioluminescence Imaging of a Chagas Disease Mouse Model for Drug Efficacy Studies

844 次观看.  Universidade de São Paulo. 我们的研究小组致力于美洲锥虫病的药物发现。我们正在寻找新的和更好的药物，并试图了解寄生虫克氏锥虫如何在宿主体内持续存在并在有效药物治疗后存活而不会产生耐药性。美洲锥虫病是一种复杂的全身性感染，需要寄生虫学治愈才能在复杂疾病发作前成功治疗。这种疾病在人类中以不同的形式表现出来，但动物模型还不能重现这种疾病...

视频: 作者聚焦：实时监测寄生虫负荷和宿主反应

To control and decrease the public health impact of human protozoan diseases such as Chagas disease, leishmaniasis, and human African trypanosomiasis, expediting the development of new drugs and vaccines is necessary. However, this process is filled with difficulties such as highly complex parasite biology and disease pathogenesis and, as typical for neglected tropical diseases, comparatively limited funding for research and development. Thus, in vitro and in vivo study models that can sufficiently reproduce infection and disease key features while providing rational use of resources are essential for progressing research for these conditions. One example is the in vivo bioluminescence imaging (BLI) mouse model for Chagas disease, which provides highly sensitive detection of long wavelength light generated by Trypanosoma cruzi parasites expressing luciferase. Despite this technique becoming the standard approach for drug efficacy in vivo studies, research groups might still struggle to implement it due to a lack of proper practical training on equipment handling and application of quality control procedures, even when suitable BLI equipment is readily available. Considering this scenario, this protocol aims to guide from planning experiments to data acquisition and analysis, with details that facilitate the implementation of protocols in research groups with little or no experience with BLI, either for Chagas disease or for other infectious disease mouse models.

The protocol provided here describes the detailed steps to perform drug efficacy studies in a bioluminescent model of Trypanosoma cruzi infection, with a focus on data acquisition, analysis, and interpretation. Troubleshooting and quality control procedures to minimize technical issues are also provided.

科研

免疫与感染

In Vivo Imaging of a Bioluminescent Mouse Model of Trypanosoma cruzi Infection for Drug Efficacy Studies

To begin, launch the imaging software on the desktop. Click on acquisition, followed by background, and view available dark charge to verify the auto background adjustment. After the software has been adjusted for imaging, inject D-Luciferin into the first three Trypanosoma cruzi-infected mice.Place the mice in a container box to check for any D-Luciferin leaks. Take notes if this happens, and register the mice group and D-Luciferin injection time. Next, anesthetize the mice and transfer them to the imaging chamber.Navigate to the acquisition window in the imaging software and set exposure time and binning. Now, click on acquire to begin imaging. If the saturated image warning sign is seen, decrease the binning, then acquire a new image.The bioluminescence-inferred parasite burden increased over the first 20 days, post infection. This was followed by a sharp decrease in parasite load over the next 30 days, resultant of acute infection. Chronic infection was seen when a constant bioluminescence was observed between days 100 to 150 post-infection.

用于药物疗效研究的克 氏锥 虫感染生物发光小鼠模型的体内成像

Data Analysis of a Bioluminescent Mouse Model of Trypanosoma cruzi Infection for Drug Efficacy Studies

To begin, launch the data analysis software on a desktop computer. Click on file, followed by browser and choose select folder to open the folder containing the acquired imaging data. Select multiple rows related to the chosen images, including the non-infected controls and excluding the supersaturated images.Write down the image ID in a lab notebook along with the information registered during a second imaging session. Click on load as group to assemble the selected images. Now click on the save icon to save the new sequence image in a new folder for re-analysis of raw data if needed.Next, click on options followed by display and select binning factor to identify the binning used for each image. The acquired binning factor will be displayed at the top of each image in the sequence. To correct all binning factors to the same value, first, double click on the image to be adjusted.On the tool pal window, click on the image adjust option, then choose the appropriate binning factor. Double click on the non-infected mice image, then select the option counts in the unit field. Adjust the color scale to a minimum value of 600.Choose the radiance options in the units field to view the radiance of the resulting image. With the sequence window active, choose the option radiance in the units field. Disable the individual box in the color scale limits area to adjust the color scale and color table in the tool palette.Mark the logarithmic scale and manual boxes, and then set the maximum scale numbers as per the non-infected control and the area with the highest signal as the maximum. After setting the same scale for all images, double click on each image, maximize the window, and use the export graphics option to export the image view in an image format. Name the files by treatment, followed by the mice ID and time point.Double click on in image from the sequence. On the tool palette window, click on the ROI tool section, then press the square icon. Draw a rectangle over the whole mouse.Click on the border of the created ROI and copy and paste the same ROI for each mouse. Next, name the ROIs to be recorded. Then click on the save icon in the ROI tool section.Select the box, apply to sequence. Then apply the saved ROIs for all images by clicking on load. Adjust the position of the ROI for each mouse to better fit them in the measurement area.When all mice have been labeled, click on the measure ROIs option. The ROI measurements table should appear. Set the measurement types to radiance, the image attributes to all possible value and the ROI dimensions to centimeters.Then click on the select all option followed by copy. Paste the data directly into the table analysis software. Organize the data columns to sort the groups properly.Next, color code the data by groups in the spreadsheet. Arrange the total flux values to match the same mouse's ventral and dorsal total flux values. Then sum them to obtain each mouse's whole body bioluminescence.Calculate the mean and standard deviation of the summed values for each group. Plot the data into a statistical software to generate graphs. Finally, create a panel with bioluminescent images.Place each mouse in columns and the time points in rows to build a drug efficacy matrix. When the bioluminescence method is applied to evaluate antiparasitic agents, a drug efficacy matrix is built to compare test compounds, exemplified here by posaconazole against the standard drug treatment used for Chagas disease, benznidazole at 100 milligrams per kilogram administered once daily. In this longitudinal study, the infection time course is illustrated by comparing a non-treated group with treated ones.The results demonstrate either a reduction in parasite burden as indicated by reduced bioluminescence, or a relapse shown by increased parasite load and consequent light detection, suggesting an ineffective compound or treatment regimen. The quantified light is represented by the sum of the ventral and dorsal total flux in photons per second as a function of infection time.