Yazarlar, ilaç etkinliği deneyleri konusunda BLI eğitimi ve desteği sağladıkları için Amanda Franscisco, John Kelly ve Fanny Escudié'ye, parazitler sağladıkları için John Kelly ve Simone Calderano'ya ve hayvan çalışmalarına destek için Gabriel Padilla'ya teşekkür eder. A.C.S, London School of Hygiene and Tropical Medicine'de (Birleşik Krallık) eğitim almak için CAPES PSDE Bursu aldı. Yazarlar ayrıca, IVIS Spektrum ekipman analiziyle ilgili teknik destek için Sao Paulo Üniversitesi (CEFAP-USP) Bilimsel Araştırma Çekirdek Tesisi'ndeki Akış Sitometrisi ve Görüntüleme Araştırmaları (FLUIR) Platformuna ve Genetik ve Sıhhi Kontrol Laboratuvarı'na teşekkür etmek isterler. Bu proje DNDi tarafından finanse edilmiştir. DNDi, 2003 yılındaki kuruluşundan bu yana tüm DNDi faaliyetleri için finansman sağlayan kamu ve özel bağışçılarına minnettardır. DNDi'nin bağışçılarının tam listesi https://dndi.org/about/donors/ adresinde bulunabilir.

Chagas Hastalığı İlaç Değerlendirmesinin In Vivo Biyolüminesan Modeli için Protokol

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Biyolüminesans görüntüleme, görünür ve kızılötesi bir elektromanyetik radyasyon spektrumu kullanarak bir rapor geninin tespit edilmesini sağlayan çığır açan bir yöntemdir. Bu nedenle, numunenizi35 izlemek için radyoaktif işaretli işaretleyicilere gerek yoktur. BLI, kemirgen modelleri ve diğer küçük türler için uygundur. Klinik öncesi çalışmalar için çok faydalıdır çünkü daha güvenlidir ve birkaç görüntü turuna izin vererek minimum hayvan rahatsızlığına neden olur. Ayrıca, biyolüminesans, floresan ve pozitron emisyon tomografisi gibi diğer tekniklerin birleştirilme olasılığı nedeniyle in vivo görüntüleme çok esnektir36.
Optik görüntüleme, absorpsiyon ve saçılma gibi optik fiziksel özellikler tarafından yönetilir. Tüm dokular, farklı dalga boylarındaki ışığı farklı şekilde emer ve saçar37. Kritik bir adım, kimyasal reaksiyon tarafından üretilen ışığın yayılan dalga boyunu hesaba katmadan bir raportör gen seçmektir. Raportör gen ekspresyon seviyesi biyolüminesan deneylerde in vitro olarak yüksek olabilirken, in vivo ortama ilerlerken aynı ekspresyon seviyeleri elde edilemeyebilir. Bu protokolde, in vivo çalışmalar için en uygun olanlardan biri olan 617 nm'de ışık yayan tripanosomatidler9 için kırmızıya kaymış Photinus pyralis luciferase (PpyRE9H)38 kodonu optimize edilmiş versiyon kullandık39. 600 nm'den daha uzun dalga boyları, özellikle hemoglobin ve melanin olmak üzere vücut endojen kromoforları tarafından daha az emilir ve saçılır. Böylece, kırmızı ışıklar birkaç santimetre dokudan iletilebilir ve fotonların iç organların içinden bile CCD kameraya ulaşmasını sağlar39,40.
Görüntüleme ayarlarındaki endişe alanlarından biri, işlevlerinin ve etkilerinin kapsamlı bir şekilde anlaşılmamasıdır. Bir ön işleme tekniği olan gruplama, bitişik dedektörler tarafından elde edilen bilgileri daha büyük bir pikselde birleştirir. Bu işlem, sinyal-gürültü oranını artırarak arka plan gürültüsünü azaltır ve hassasiyeti artırır. Bununla birlikte, uzamsal çözünürlük doğruluğunu azaltarak pikselli bir görüntüyeneden olur 41,42. Bu değiş tokuş, görüntüleme stratejinizde önemli bir husustur.
Chagas hastalığı34 için Hedef Ürün Profili ve Hedef Aday Profiline dayanarak, kavram kanıtlama çalışması, T. cruzi'yi tespit etme ve yeni bir ilaç adayının steril bir tedavi sağlayıp sağlayamayacağını belirlemeye yardımcı olma duyarlılığına odaklanmıştır (birkaç immünosupresyon turundan sonra nüks eksikliği ile temsil edilir). Bu nedenle, görüntüyü aşırı doygunlaştırmadan en yüksek gruplama faktörünü kullanarak BLI'yi yürütürüz. Görüntü aşırı doygunluğa ulaştığında, daha düşük bir gruplama faktörü kullanılarak yeni bir alım gerçekleştirilir. Analiz sırasında, farklı gruplama gerektiren görüntülere matematiksel bir düzeltme uygulanır. Bu şekilde, nihai veriler aynı gruplama kullanılarak sunulmalıdır. Tablo 1 , aynı görüntüde ve ROI'lerde farklı gruplama faktörleri uygulandığında elde edilen farklı değerleri göstermektedir.
Tablo 1: Gruplama ayarlarının BLI niceliği üzerindeki etkisi. Akut model (d13) ve kronik model (d118) görüntüsünde üç ROI'nin ölçülmesi, farklı gruplama faktörlerinde analiz edildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/DaSilvaetal_Table1_Reviewed.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Klinikte Chagas hastalığının mevcut senaryosu nedeniyle, ilaç keşif çabaları parazitleri tamamen ortadan kaldırmayı amaçlamaktadır (parazitolojik tedavi)27,34. Bu nedenle, in vivo preklinik protokol, BLI teknik duyarlılığının sınırlamalarının üstesinden gelen yaklaşımları içerir. Yaklaşımlardan biri, parazit yükünü kontrol eden bağışıklık tepkisini azaltmak için fareleri siklofosfamid ile tedavi etmektir. Başka bir strateji, doku derinliğini azaltmak ve kameraya giden ışık yolunu engelleyen kas, deri ve kürk katmanlarını çıkarmaktır. Ex vivo prosedür sayesinde, Posa ile tedavi edilen farenin ex vivo sonucu Şekil 5C'de gösterildiği gibi, in vivo BLI eşiğinin altında parazit odaklarını ortaya çıkaran küçük biyolüminesan noktalar tespit edilebilir.
Modelin kendisini ve enfeksiyon dinamiklerini değerlendirmek için bir pilot deney tasarlamak, antiparaziter ilaç etkinliği değerlendirmesi için doğru bir deney oluşturmak için çok önemlidir. Bu nedenle, araştırmacı uygun BLI ayarlarını ve enfeksiyon zaman seyrini önceden tanımlayabilecektir. Keşif amaçlı bir deneyde, edinim ayarlarını tanımlamaya yardımcı olabilecek bir araç 'Otomatik Pozlama'dır. Bu araçla araştırmacı, mümkün olan en iyi görüntüyü elde etmek için üç ayarın (Pozlama süresi, Gruplama ve F/Stop) önceliğini belirler. Özellikle, araştırmacı, görüntülerin CCD kameranın dinamik aralığı içinde, aşırı doygunluk veya düşük pozlama olmadan, ölçeğin ve otomatik pozlama özelliğinin minimum ve maksimum sınırları aracılığıyla kontrol edilebilen, elde edilmesini sağlamalıdır (Menü Düzenleme > Tercihler > Sekme Alma > Sekme Otomatik Pozlama). Bu protokolde, kamera açıklığı maksimum değere (F/Stop: 1) ayarlandı ve akut ve kronik modeller için farklı pozlama süreleri ve gruplama faktörleri tanımlandı. Bu ayarlar, aynı anda farklı görüntü turları gerçekleştirmek için zaman öngörülebilirliği sağlar. Raportör yönteminin bir enzimatik reaksiyona dayandığı göz önüne alındığında, hem substratın fareye biyolojik dağılımı hem de lusiferaz kinetiği, biyolüminesan sinyalini ve dolayısıyla enfeksiyon miktarını etkiler (Şekil 1B). Sonuç olarak, enzimatik kinetik momentlerinde görüntü elde etmek, açıklanamayan veya düzeltilemeyen veri değişkenliğini ortaya çıkarır ve toplam akı (fotonlar/saniye) veya parlaklık (fotonlar/saniye/cm2/steradyan) hesaplamasını etkiler. Ayrıca, T. cruzi enfeksiyonu farelerde dinamik uzamsal konumlandırma gösterir (farklı alanlar ve dokular, derinlik ve parazit yükü). Bu nedenle, elde edilecek sayımların bir değerini belirlemek, başka bir daha güçlü sinyalin kaynağı tanımlanan otomatik maruz kalma kriterlerini karşılıyorsa, daha zayıf sinyal kaynaklarını (dokunun daha derin bir noktasında düşük sayıda parazit) gözden kaçırabilir.
Living Image yazılımının zor bir özelliği, elde edilen görüntüyü otomatik bir renk ölçeğinde görüntülemektir. Seçilen ölçek değerlerine göre otomatik olarak yepyeni bir edinilmiş görüntüyü gösterecek şekilde ölçeği önceden ayarlama seçeneği yoktur (bkz. protokol adımı 6.2). Bu durum, araştırmacıyı görüntüleri tek tek manuel olarak seçilen maksimum ve minimum değerlere değiştirmeye zorlar. Sonuç olarak, deneyimsiz ve iyi eğitimli olmayan kullanıcılar, edinme oturumu sırasında uygun okumaya sahip olamazlar ve o noktada verileri yanıltabilir veya önemli bilgileri kaybedebilirler. Bunun için pilot deney faydalıdır.
Kavram kanıtı deney tasarımı ile ilgili en yaygın sorulardan biri, tedavi süresinin ve dozunun nasıl seçileceğidir. Yeni kimyasal varlıklar için, bu parametreler genellikle, ilaç metabolizması ve farmakokinetiği (DMPK) tarafından oluşturulan veriler ve etkinlik için in vivo testlerden önce yürütülen tolere edilebilirlik çalışmaları ile kombinasyon halinde, in vitro bileşik potens ve seçicilik ile tanımlanır. Özetle, hücrelerin içindeki paraziti seçici olarak öldürebilen bileşikleri belirledikten sonra, ilk ADME deneyleri (absorpsiyon, dağılım, metabolizma ve atılım), diğer parametrelerin yanı sıra bileşiklerin suda çözünürlüğünü, hücre geçirgenliğini ve metabolik stabilitesini tahmin etmek için in vitro olarak gerçekleştirilir. Bileşikler in vitro özelliklerin iyi bir dengesini gösteriyorsa (genellikle hedef aday profillerinde tanımlanır), bu adaylar sağlıklı farelerde in vivo farmakokinetik (PK) çalışmalara ilerletilir, bu da kandaki (ve muhtemelen dokularda) bileşik maruziyetini ana hatlarıyla belirtir ve farklı doz seviyelerinde tolere edilebilirlik hakkında genel bir fikir verir17, 34,43. İdeal olarak, çoğu bulaşıcı hastalıkta PK değerlendirmesinin amacı, EC50/EC90 konsantrasyonlarının44 üzerindeki serbest plazma konsantrasyonlarına (plazma protein bağlanması için düzeltilmiş) ulaşmanın fizibilitesini belirlemektir - parazitlerin sırasıyla %50 veya %90'ını öldüren veya en azından büyümesini engelleyen etkili konsantrasyon - yeterince uzun bir süre boyunca. Belirli bir doz seviyesinde yeterli maruziyet elde edilirse, bu rejim Chagas BLI modeli kullanılarak yapılan etkinlik çalışmaları sırasında kullanılabilir. İlaç yeniden konumlandırma çalışmaları için in vitro ve in vivo PK verileri mevcut olmalıdır. İlacın yeniden profillenmesi için iyi bir başlangıç, test edilecek güvenli ve toksik olmayan tedavi rejimlerini tahmin etmek için allometrik ölçeklendirme46 kullanılarak farelere dönüştürülebilen tanınmış veriler sağlayan PubChem45 gibi kimyasal veri tabanlarıdır. Ancak, bu her zaman böyle değildir. PK çalışmaları, akademik bilimde hala göz ardı edilen bir alandır ve çok az ilaç şirketi PK sonuçlarını yayınlamaktadır. İlaç keşfi bilim topluluğu, in vivo PK değerlendirmesinin yanı sıra ilaç etkinliği deneyleri (farmakodinamik) dahil edilmesini önermektedir47. Bu nedenle, klinik öncesi görüntüleme, eş zamanlı olarak bileşik ölçümlerle uyumludur ve bu ilişkili yaklaşım, veri sağlamlığını artırır.
Ek olarak, farelerin kullanımı, ağırlığı ve sağlık koşulları tüm deney boyunca izlenir. Kamburlaşma, titreme, denge kaybı, hareket etme isteksizliği, beslenmeye veya içmeye isteksizlik, secde veya grupta veya bireysel fare koşullarında mevcut olan diğer anormallikler gibi toksisite belirtileri ve yan etkiler klinik öncesi çalışmalarda kaydedilmeli ve rapor edilmelidir. Optik görüntülemenin amaçlarından biri de hayvanların refahını sağlamaktır. Bu nedenle, 'Yüz buruşturma ölçeği48'de açıklanan ağrı belirtileri olan farelerde insancıl uç noktalar uygulanmalıdır. Ayrıca, fareler BLI alımı sırasında ve daha sık olarak ilaç dozu ve CTX tedavisi sırasında haftalık olarak tartıldı. Hayvan refahı düzenlemelerine göre, vücut ağırlığının %20'sinden fazlasını kaybeden fareler derhal insancıl bir şekilde ötenazi yapılmalıdır.
T. cruzi biyolüminesan modeli, Chagas hastalığı için yeni tedavilerin keşfedilmesi ve geliştirilmesi için son teknoloji deneysel modeldir. T. cruzi enfeksiyonu ve Chagas hastalığı49'un temel özelliklerini çoğaltan, paraziteminin gerçek zamanlı izlenmesine ve bilinen etki modlarıyla ilişkili çeşitli etkinlik profillerine sahip bileşiklerin farklılaşmasına izin veren bir model. BLI, enfekte olmuş dokuları tanımlamada atılganlığı artıran bir tekniktir. Enfekte dokuların hassas seçiminin, T. cruzi araştırmasında50,51 halihazırda uygulanmış olan tüm klasik yöntemler de dahil olmak üzere çok çeşitli yaklaşımlarda kullanılmasını sağlar. Ek olarak, araştırmacıların en son teknolojileri keşfetmelerine ve yenilerini geliştirmelerine olanak tanır33. Ek olarak, BLI, aynı anda 3R ilkelerine10,35 göre hayvan refahının iyileştirilmesini ve daha rasyonel kullanımını sağlar.
İhmal edilen tropikal hastalıklara odaklanan birçok araştırma grubu, in vivo görüntüleme cihazlarının bulunmadığı ülkelerde yer almaktadır. Mevcut senaryonun üstesinden gelmek için, Global BioImaging ve ilgili konsorsiyumları gibi yeni uluslararası ağlar, görüntüleme çekirdek tesislerine açık erişim sağlamak ve personel ile görüntüleme bilimcilerinin eğitimini iyileştirmek için eylemleri teşvik etmektedir 52,53. Bu girişimler, bunun gibi kullanıcı dostu protokollerle birlikte, tüm araştırmacılar için üst düzey teknolojileri demokratikleştiren koşulları karşılayabilir. Bu yöntemin klinik öncesi ilaç keşfinde uygulanması, Chagas hastalığı için ilaç keşfini kolaylaştıran sağlam bir etkinlik okuması ve klinik sonucun prediktif değerini sunmuştur.

Chagas hastalığı Latin Amerika'da endemiktir ve dünya çapında yaklaşık yedi milyon insanı etkilemektedir1. Her yıl 50.000'den fazla ölüm ve yaklaşık 7 milyar dolarlık ekonomik kayıp, bu hastalığın engelleyici doğasından kaynaklanmaktadır2. Chagas hastalığına, vektörel iletimin kurulduğu Amerika'da memelileri (vahşi ve evcil) ve triatomin vektörlerini (Hemiptera, Reduviidae)3 enfekte edebilen heteroksenik bir hemoflagellat parazit olan protozoan Trypanosoma cruzi neden olur. Diğer önemli enfeksiyon yolları arasında kan transfüzyonu, organ nakli, oral (enfekte bir triatomin ile kontamine olmuş gıdaların yutulmasıyla)4 ve konjenital bulaşma yer alır. Vektörel olmayan bulaşma yolları, Chagas hastalığının endemik olmayan bölgelere yayılmasına katkıda bulunmuştur 3,5.
Chagas hastalığı iki klinik aşamada kendini gösterir. Akut faz çoğu durumda asemptomatiktir. Semptomatik enfeksiyonlar genellikle ateş, yorgunluk, kas ağrısı, lenfadenopati, splenomegali ve hepatomegali gibi spesifik olmayan belirtilerle ilişkilidir. Akut faz ayrıca sıklıkla patent parazitemisi ve parazitlerin sistemik dolaşımı ile ilişkilidir. Teşhis edilen vakaların %10 kadarında, özellikle oral enfeksiyon olanlarda ölüm meydana gelebilir6. Kronik faz genellikle herhangi bir semptomun uzun süre yokluğu ile karakterizedir. Zamanla, onlarca yıl önce enfekte olan hastaların yaklaşık üçte biri, genellikle fibroz ve miyokard iltihabının eşlik ettiği kardiyak bulgular ve/veya çoğunlukla megaözofagus ve/veya megakolon sendromlarının gelişimi ile ilişkili gastrointestinal bozukluklar sergiler 3,5,6.
Chagas hastalığının etiyolojik tedavisi sadece iki ilaçtan oluşur: benznidazol ve nifurtimox. Bu antiparaziter ajanlar 50 yılı aşkın bir süredir mevcuttur ve önemli toksisiteye ve sınırlı etkinliğesahiptir 5,7,8. Sonuç olarak, Chagas hastalığı hastaları için yeni, güvenli ve daha etkili tedaviler geliştirmeye acil bir ihtiyaç vardır.
Daha sofistike ve doğru teknikler, Chagas hastalığı için yeni tedaviler arayışında ilerlemelere izin veren eski soruların cevaplarını elde etmeyi mümkün kılmaktadır. Bu anlamda, bilim camiası, enfeksiyonun seyri ve ilaç etkinliğinin değerlendirilmesi üzerine in vivo çalışmalar için genetiği değiştirilmiş parazitlerden büyük ölçüde yararlanmaktadır 9,10,11,12. Biyolüminesans görüntüleme (BLI) sistemine dayalı uzunlamasına bir test, tedavi rejimi sırasında ve sonrasında etkinlik değerlendirmesine izin vererek, tripanosidal aktiviteye sahip bileşiklerin tanımlanmasına yol açar10,13. BLI yöntemi, genetik olarak değiştirilmiş T. cruzi CL Brener Luc::Neon soyu11 tarafından üretilen ışığın nicelleştirilmesi yoluyla hem dolaşımda hem de doku ve organlarda parazit yükünün doğrudan ölçümünü sağlar ve bu da kırmızıya kaymış ateşböceği lusiferaz12'yi yapısal olarak ifade eder.
Bununla birlikte, Chagas hastalığı BLI hayvan modelinin ve ilaç etkinliği çalışmalarının kurulmasından yaklaşık 10 yıl sonra, sadece birkaç araştırma grubu bu tekniğe hakimdir. Bu gerçek, yalnızca uygun görüntüleme ekipmanına erişimin azalmasından değil, aynı zamanda eğitim eksikliğinden ve yapılandırılmış, ayrıntılı protokollerin mevcudiyetinden de kaynaklanmaktadır. Bu yöntem, parazit DNA tespiti için mikroskopi, seroloji veya qPCR ile organ/doku enfeksiyonu değerlendirmesi ile paraziteminin değerlendirilmesine dayanan diğer yaklaşımlara göre çeşitli avantajlar sunar, çünkü farelerin refahını iyileştirir ve daha sağlam ve entegre in vivo veri üretme olasılığı ile hayvan kullanımının azaltılmasına izin verir. Ayrıca, bu yöntem, ilaç tedavisinden sonra iç organlardaki parazit odaklarının hazır tespitini sağladığı için tartışmasız daha hassastır10,12. Bu nedenle, bu protokol, Parazitoloji ve diğer enfeksiyon hastalıkları ile ilgili araştırma gruplarına, teknik prosedürleri detaylandırarak laboratuvarlarında bu metodolojiyi kurmaları için rehberlik etmeyi amaçlamaktadır. Burada, İhmal Edilen Hastalıklar için İlaçlar girişimi (DNDi) tarafından koordine edilen ilaç keşif çabalarının bir parçası olarak, Latin Amerika'da türünün ilk örneği olan Chagas hastalığı BLI modelinin Brezilya'da uygulanmasıyla elde edilen deneyimi paylaşıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >BD LSRFortessa&#8482; X-20 Cell Analyzer</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Weighing Balance (animal facility)</td>
			<td>Available from several suppliers</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IVIS Spectrum In Vivo Imaging System</td>
			<td >Revvity (former PerkinElmer)</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FlowJ Software v10.7.1</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Living Image Software for Spectrum v4.7.1</td>
			<td >Revvity (former PerkinElmer)</td>
			<td ></td>
			<td>License Free Analysis Software called &#39;Aura Imaging&#39; could be used for the most basic features provided by Spectral Instruments Imaging (Bruker company) (https://spectralinvivo.com/software/)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microsoft Office software</td>
			<td >Microsoft</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GraphPad Prism v8.4.0</td>
			<td >GraphPad Software Inc.</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DMEM Low Glucose</td>
			<td>Vitrocell</td>
			<td >D0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >S5761-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Foetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td >16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td >15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Trypsin 0.5% EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td >25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LIT medium</td>
			<td>In house</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hygromycin B (50 mg/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td >10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grace&#8242;s Insect Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td >G9771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td >54457</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >IVISBrite d-luciferin potassium salt</td>
			<td>Revvity (former PerkinElmer)</td>
			<td >122799</td>
			<td>Also could be used: VivoGlo Luciferin, in vivo grade (Promega/P1043); D-Luciferin, Monopotassium Salt (Thermo Scientific/88293) or PierceD-Luciferin, Monosodium* Salt (Thermo Scientific/88291); D-Luciferin, Potassium Salt (GoldBio/LUCK or eLUCK); D-Luciferin, Sodium* Salt (GoldBio/LUCNA or eLUCNA) *Sodium or potassium salt differences relies minimal chances on solubility, however do not affect in vivo performance.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td >21600-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cyclophosphamide (CTX)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >C0768-5g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >D5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >(Hydroxypropyl)methyl cellulose (HPMC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >09963-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Benzyl alcohol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td >402834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tween 80</td>
			<td>Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td >P1754-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Benznidazole</td>
			<td>ELEA</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Posaconazole (Noxafil commercial formulation)</td>
			<td>Schering-Phough</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Giemsa</td>
			<td>Available from several suppliers</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >gavage needle (stainless-steel straight) - 22GA</td>
			<td>Aton</td>
			<td >&#160;CA2003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 mL Syringe and 31G needle</td>
			<td>Available from several suppliers</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 mL Syringe and removable 26G needle</td>
			<td>Available from several suppliers</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 mL Syringe and removable 24G X&#190; needle</td>
			<td>Available from several suppliers</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile Syringe Filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Available from several suppliers</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >A4 Matte Black paper 120gr or thicker</td>
			<td>Paper Color/ Canson (Available from several suppliers)</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >aluminum foil</td>
			<td>Available from several suppliers</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neubauer chamber</td>
			<td>Available from several suppliers</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

demystifying in vivo bioluminescence imaging of a chagas disease mouse model for drug efficacy studies

Chagas hastalığı, leishmaniasis ve insan Afrika tripanozomiyazisi gibi insan protozoan hastalıklarının halk sağlığı üzerindeki etkisini kontrol etmek ve azaltmak için yeni ilaçların ve aşıların geliştirilmesini hızlandırmak gereklidir. Bununla birlikte, bu süreç, oldukça karmaşık parazit biyolojisi ve hastalık patogenezi gibi zorluklarla doludur ve ihmal edilen tropikal hastalıklar için tipik olarak, araştırma ve geliştirme için nispeten sınırlı fonlar. Bu nedenle, in vitro ve in vivo kaynakların rasyonel kullanımını sağlarken enfeksiyon ve hastalığın temel özelliklerini yeterince yeniden üretebilen modeller, bu koşullar için araştırmaları ilerletmek için gereklidir. Bir örnek, lusiferaz eksprese eden Trypanosoma cruzi parazitleri tarafından üretilen uzun dalga boylu ışığın oldukça hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlayan Chagas hastalığı için in vivo biyolüminesans görüntüleme (BLI) fare modelidir. Bu tekniğin in vivo çalışmalarda ilaç etkinliği için standart yaklaşım haline gelmesine rağmen, araştırma grupları, uygun BLI ekipmanı hazır olsa bile, ekipman kullanımı ve kalite kontrol prosedürlerinin uygulanması konusunda uygun pratik eğitim eksikliği nedeniyle bunu uygulamakta hala zorlanabilir. Bu senaryo göz önüne alındığında, bu protokol, Chagas hastalığı veya diğer bulaşıcı hastalık fare modelleri için BLI ile çok az deneyimi olan veya hiç deneyimi olmayan araştırma gruplarında protokollerin uygulanmasını kolaylaştıran ayrıntılarla, deneylerin planlanmasından veri toplama ve analizine kadar rehberlik etmeyi amaçlamaktadır.

Chagas disease is endemic in Latin America and affects approximately seven million people worldwide1. Annually, more than 50,000 deaths and economic losses of around 7 billion dollars&#160;result from the disabling nature of this disease2. Chagas disease is caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, a heteroxenic hemoflagellate parasite capable of infecting mammals (wild and domestic) and triatomine vectors (Hemiptera, Reduviidae)3 in the Americas, where the vectorial transmission is established. Other important infection routes include blood transfusion, organ transplantation, oral (by the ingestion of food contaminated with an infected triatomine)4, and congenital transmission. Non-vectorial transmission routes have contributed to the spread of Chagas disease to non-endemic areas3,5.
Chagas disease manifests in two clinical phases. The acute phase is, in most cases, asymptomatic. Symptomatic infections are usually associated with non-specific signs such as fever, fatigue, myalgia, lymphadenopathy, splenomegaly, and hepatomegaly. The acute phase is also often associated with patent parasitemia and systemic circulation of parasites. Death may occur in up to 10% of the diagnosed cases, especially in those of oral infection6. The chronic phase is often characterized by a long period of absence of any symptoms. With time, approximately one-third of the patients infected decades earlier exhibit cardiac manifestations, usually accompanied by fibrosis and myocardial inflammation, and/or gastrointestinal disorders mostly related to the development of megaesophagus and/or megacolon syndromes3,5,6.
The etiological treatment of Chagas disease consists of only two drugs: benznidazole and nifurtimox. These antiparasitic agents have been available for over 50 years and have considerable toxicity and limited efficacy5,7,8. Consequently, there is a pressing need to develop new, safe, and more efficacious treatments for Chagas disease patients.
More sophisticated and accurate techniques make it possible now to obtain answers to old questions that allow advances in the search for new treatments for Chagas disease. In this sense, the scientific community greatly benefits from genetically modified parasites for in vivo studies on the course of infection and evaluation of drug efficacy9,10,11,12. A longitudinal assay based on the bioluminescence imaging (BLI) system allows efficacy evaluation during and after the treatment regimen, leading to the identification of compounds with trypanocidal activity10,13. The BLI method provides a direct measurement of parasite load, both in circulation or in tissues and organs, through the quantitation of light produced by the genetically modified T. cruzi CL Brener Luc::Neon lineage11, which constitutively expresses the red-shifted firefly luciferase12.
Nonetheless, nearly 10 years after the establishment of the Chagas disease BLI animal model and drug efficacy studies, only a few research groups dominate this technique. This fact is due to not only the reduced access to proper imaging equipment but also the lack of training and availability of structured, detailed protocols. This method presents several advantages over other approaches, which rely on the assessment of parasitemia by microscopy, serology, or organ/tissue infection evaluation by qPCR for parasite DNA detection, as it allows improved mice well-being and reduction of animal use by the possibility of generation of more robust and integrated data in vivo. Furthermore, this method is, arguably, more sensitive, as it enables ready detection of parasite foci in visceral organs after drug treatment10,12. Therefore, this protocol aims to guide research groups on Parasitology and other infectious diseases to establish this methodology in their laboratories by detailing the technical procedures. Here, we share the experience obtained through implementing of the Chagas disease BLI model in Brazil, the first of its kind in Latin America, as part of the drug discovery efforts coordinated by the Drugs for Neglected Diseases initiative (DNDi).

Yazar Spotlight: Parazit Yükünün ve Konak Yanıtının Gerçek Zamanlı İzlenmesi

İlaç Etkinliği Çalışmaları için Bir Chagas Hastalığı Fare Modelinin In Vivo Biyolüminesans Görüntülemesinin Gizeminin Çözülmesi

Our research group works in drug discovery for Chagas disease. We are searching for new and better drugs, and also trying to understand how the parasite, Trypanosoma cruzi, can persist in the host and survive even after efficacious drug treatment without developing drug resistance. Chagas disease is a complex systemic infection that requires parasitological cure to be treated with success before the onset of the complicated disease.The disease manifests in different forms in humans, but animal models cannot yet reproduce all important aspects of the disease. Ideally, new antiparasitic drugs for Chagas disease should promote parasitological cure, meaning the eradication of Trypanosoma cruzi parasites from the host. These protocols allows the realtime tracking of parasite burden in mice, and to differentiate compounds that only transiently suppress the parasitemia from those that can promote parasitological cure.This protocol allows for noninvasive reduced animal use and monitoring of mice during both acute and chronic infection, and also enables for monitoring of visceral infection in real time. Using a similar protocol, we are developing new methods for understanding how drug therapy may benefit the host by preventing the onset and treating complicated Chagas disease. We will also continue to do research on the factors involving Trypanosoma cruzi evasion of drug treatment.

Yapısal olarak lusiferazı eksprese eden transgenik parazitlere dayanan yeterli bir fare modeli kullanarak, konakçıya minimum zarara neden olan anahtar insan T. cruzi enfeksiyon özelliklerini yeniden üretmek mümkündür, bu da parazitlerin konakçının tüm vücut BLI'si ile uzunlamasına (ömür boyu) bir şekilde gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak tanır, birkaç aya kadar12.
Şekil 3 , BALB/c farelerinde enfeksiyondan sonraki 1. günden 150 dpi'ye kadar CL Brener Luc::Neon enfeksiyonu zaman seyrini gösteren bir pilot deneyi göstermektedir. İlk 20 dpi'de, parazitemi zirvesine özgü biyolüminesans ile çıkarılan parazit yükü artar, bunu farelerin bağışıklık kontrolüne bağlı olarak parazit yükünde keskin bir azalma izler. Bu nedenle, enfeksiyonun akut fazı ilk 50 dpi olarak kabul edilir. Kronik faz, enfeksiyon 100-150 dpi arasında sabit bir biyolüminesan hızına ulaştığında tanımlanır.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66740/66740fig03v2.jpg"> Şekil 3: Modeli anlama. Trypanosoma cruzi CL Brener Luc'un kinetiği::BALB/c farelerinde neon enfeksiyonu (n = 11). Üst panel: intraperitoneal enjeksiyon ile 1 x 10³ kan dolaşımı tripomastigotları ile enfeksiyon sonrası 150 gün (dpi) boyunca farklı zaman noktalarından ventral ve dorsal biyolüminesan görüntüler. Parlaklıkta (p/s/cm, 2/sr) biyolüminesan sinyalin ısı haritası ölçeği (Günlük10'da). Renk kodu: Mor = 5 x 103; kırmızı = 1 x 107. Alt panel: tüm vücut farelerinin Toplam Akısı (p/s) cinsinden biyolüminesan sinyal ölçümü. Veriler ortalamalar (çizgiler) ve standart sapmalar (gölgeli bölgeler) olarak ifade edilir. Bu fare modelinde enfeksiyonun akut ve kronik fazları için tanımlanan dönemler turuncu renkle vurgulanmıştır. Enfekte olmayan farelerin (n = 3) lüminesans ortalama değerleri eşik (açık gri çizgi) olarak gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/66740fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Enfeksiyonun ana fazları bir fare modelinde iyi bir şekilde yeniden üretildiği için terapötik sonuçlar da tahmin edilebilir. Bu nedenle, BLI artık bileşik etkinlik potansiyeli ve geliştirme hattındaki ilerleme hakkında karar vermeyi destekleyen kavram kanıtı çalışmaları yoluyla çeviri bilimine uygulanmaktadır10,27. Akut fare modelinde, enfeksiyon parazitemi zirvesine ulaştığında (yaklaşık 14-21 dpi) oral tedaviye başlanmalıdır, bu da kan dolaşımında yüksek sayıda tripomastigot (yaklaşık 1 x 105 tripomastigot/mL - veriler gösterilmemiştir) ve sistemik enfeksiyon ile karakterize edilir. Kronik fazda, fare tedavisi, parazit yükünün nispeten çok daha düşük olduğu 100 dpi'de başlar ve stabil alt patent parazitemisi vardır.
Antiparaziter ajanların değerlendirilmesinde yukarıda tarif edilen protokolün uygulanmasını göstermek için, Chagas hastalığının tedavisinde kullanılan standart ilaç olan benznidazol (BZ) ve Chagas hastalığı için klinik çalışmalarda başarısız olan ve ayrıca T. cruzi'ye karşı antiparaziter ajan olarak etkisiz olduğu gösterilen bir sterol 14α-demetilaz (CYP51) inhibitörü olan posakonazolün (Posa) tedavi etkinliğini karşılaştırdık , bu protokolde açıklanan BLI modeli de dahil olmak üzere 13,18,28,29,30.
Akut fare modeli için, grup başına 6 fareden oluşan kohortlar, günde bir kez 20 mg / kg'da Posa veya 100 mg / kg'da BZ ile 20 gün boyunca gavaj31 ile oral olarak tedavi edildi. Fareler ayrıca kısa tedavilerin etkisini değerlendirmek için günde bir kez 100 mg / kg'da 5 gün boyunca BZ ile tedavi edildi. Bileşik eliminasyondan sonra (tedavi sona erdikten 10 gün sonra), BLI negatif fareler immünosuprese edildi, bu da parazitolojik bir tedavi sağlanamadığında enfeksiyonun nüksetmesini teşvik eden bir durumdur (Şekil 4A). Posa tedavisi, tedavinin sonunda biyolüminesans ile çıkarılan parazit yükünde% 99.49 ±% 0.27 (ortalama ± standart sapma) azalma ile sonuçlandı ve ilaç bileşiği eliminasyon süresi boyunca enfekte olmayan farelerin benzer seviyelerinde kaldı (40 dpi'de geçici bir sinyal ile fare # 3 ve 44 dpi'de zayıf bir BLI noktası gösteren fare # 2 hariç). Tedavi edilmeyen grupla karşılaştırıldığında, 20 günlük BZ tedavisi, tedavi sonunda biyolüminesans ile ortaya çıkan parazit yükünü %100 ± %0.01 azalttı. Buna karşılık, BZ ile 5 günlük kısa tedavi, 19 dpi'de (eşik seviyesine benzer) %99,98 ± %0,03'lük bir azalmaya yol açtı. Bununla birlikte, bu durumda, BLI azalması geçiciydi ve sonraki edinimlerde, tüm fareler enfeksiyon reaktivasyonu gösterdi (Şekil 4B).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66740/66740fig04v3.jpg"> Şekil 4: Chagas hastalığı akut modelinde biyolüminesans görüntüleme ile elde edilen kavram kanıtı deney tasarımı ve sonuçları. (A) Bileşik etkinliğinin değerlendirilmesi için klinik öncesi çalışmalar için akut Chagas hastalığı fare modelinde zaman çizelgesi sürecinin şematik şeması. Siyah noktalar: zaman noktalarını görüntüleme. İlaç şişesi ve turuncu çubuk: sırasıyla tedavi başlangıcı ve bitişi. Şırınga simgesi: siklofosfamid enjeksiyonları. DPI: enfeksiyondan sonraki gün. Renk kodu: gri = tedavi edilmemiş enfeksiyon; turuncu = tedavi süresi; mavi = bileşik eliminasyon aşaması; Sarı = immünosupresyon dönemi. (B) Trypanosoma cruzi'nin tedavi süresi. Sol panel: BALB / c farelerinin ventral biyolüminesans görüntüleri (i) (ii) 20 mg / kg'da posakonazol (Posa), (iii) 20 gün boyunca tedavi edilmiş 100 mg / kg'da benznidazol (BZ) ve (iv) (n = 6 / grup) ile 5 gün boyunca tedavi edilmiş 100 mg / kg'da BZ. Tüm tedaviler günde bir kez gavaj (10 mL/kg) oral yoldan uygulandı. Log10 ölçekli ısı haritası, düşük seviyeden (mavi) yükseğe (kırmızı) kadar biyolüminesan sinyal yoğunluğunu gösterir. Sağdaki grafik: biyolüminesans görüntüleme verilerinin tüm vücut ölçümü. Veriler ortalamalar (çizgiler) ve standart sapmalar (gölgeli bölgeler) olarak ifade edilir. Anahtar: İlaç şişesi: tedavi başlangıcı (14 dpi); turuncu çubuk: tedavi sonu (18 dpi/33 dpi); şırınga simgesi siklofosfamid enjeksiyonları (44-53. günden itibaren); turuncu nokta: ex vivo prosedürle analiz edilen fare; § idrarda D-lusiferin sızıntısı nedeniyle hariç tutulan veriler. (C) Organ ve dokularda T. cruzi odaklarının tespiti için ex vivo prosedür. Plaka dağıtım anahtarı şeklin altında sunulmuştur (BioRender.com: ZY26LG8AOF ile oluşturulmuştur). İn vivo panelde gösterilenle aynı parlaklık ölçeği. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/66740fig04largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Bu modelde, antiparaziter tedavi, parazit yükünü 1000 parazitin BLI tespit sınırının altına düşürebilir. Böylece, fareler BLI negatif10 olarak görünür. Parazitolojik bir tedavinin elde edildiğinden emin olmak için, siklofosfamid tedavisi29,32 kullanılarak farelerin immünosupresyonunu teşvik etmek gerekir. İlaç tedavisinden sonra hala tespit edilemeyen bir parazit yüküne sahip olan fareler, immünosupresyondan sonra BLI pozitif hale gelecektir. Bu etki, parazit nüksetmesini teşvik eden akut modelde Posa tedavisi ile daha yaygın olarak gösterilmiştir. Bu deneyde, parazit dokusu tropizmini değerlendirmek için en düşük biyolüminesan sinyale sahip fareler üzerinde ex vivo prosedürü gerçekleştirildi (Şekil 4C). Tedavi edilmeyen fareler, özellikle gastrointestinal sistemde (TGI) ve viseral yağ ve mezenter gibi ilişkili dokularda güçlü biyolüminesan sinyaller gösterir. Ek olarak, cilt parazit kalıcılığı ile ilişkili bir bölgeydi. Posa ile tedavi edilen fareler, kolon, mezenter ve viseral yağ ile daha sınırlı olan daha düşük yoğunluklu biyolüminesan lekeler sundu. Öte yandan, 20 gün boyunca BZ 100 mg / kg olarak iyileştirici bir tedavi rejimi ile tedavi edilen farelerde, immünosupresyon altında bile biyolüminesan sinyal tespit edilmez. Bu nedenle, biyolüminesan sinyalin 1000 parazit10 eşik seviyesinin üzerine çıkması için koşulların teşvik edilmesinden ve iç organların açığa çıkarılmasıyla duyarlılığın arttırılmasından sonra, 20 gün boyunca BZ 100 mg / kg'ın steril kür sağladığı düşünülmektedir. Steril kürün değerlendirilmesi daha önce farklı tekniklerle doğrulanmıştır 10,13,17,33,34.
Benzer bir çalışma tasarımı, farelerin (n = 6 / grup) enfeksiyondan sonraki 100. günde tedavi edilmeye başlandığı kronik modele (Şekil 5A) uygulandı. Bu noktada, Posa 20 mg / kg, 100 mg / kg'da BZ veya günde bir kez 10 mg / kg 20 gün boyunca oral yoldan uygulandı. İlaç eliminasyon süresinden sonra, BLI negatif fareler immünosuprese edildi. Ek olarak, steril kürü değerlendirmek için, immünosupresyon fazının sonunda hala BLI negatif olan fareler ex vivo analize tabi tutuldu.
Kronik enfeksiyonda, 20 mg / kg'da Posa ile tedavi, tedavinin sonunda biyolüminesans ile indüklenen parazit yükünde% 95.03 ±% 6.18'lik bir azalmaya yol açtı ve ilaç eliminasyon süresi boyunca enfekte olmayan farelerin benzer seviyelerinde kaldı. İmmünosupresyondan sonra, farelerin çoğu değişken bir BLI sinyali ve dağılımı seviyesi gösterdi (Şekil 5B). Ex vivo prosedür, Posa ile tedavi edilen bir tüm vücut BLI negatif farenin, ex vivo muayene ile tespit edilebilen kolonda biyolüminesan bir noktaya sahip olduğunu ortaya koydu (Şekil 5C).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66740/66740fig05v3.jpg"> Şekil 5: Biyolüminesans görüntüleme ile Trypanosoma cruzi enfeksiyonunun kronik modelinde elde edilen ilaç değerlendirme deney tasarımı ve sonuçları. (A) Kronik Chagas hastalığı fare modelinin deney tasarımının şematik şeması. Siyah noktalar: zaman noktalarını görüntüleme. İlaç şişesi ve turuncu çubuk: sırasıyla tedavi başlangıcı ve bitişi. Şırınga simgesi: siklofosfamid enjeksiyonları. Dpi: enfeksiyondan sonraki gün. Renk kodu: Gri = tedavi edilmemiş enfeksiyon; turuncu = tedavi süresi; mavi = bileşik eliminasyon aşaması; sarı = immünosupresyon; leylak = nüks. (B) Chagas hastalığı kronik modelinde tedavi etkinliğinin boylamsal değerlendirmesi. Sol panel: BALB / c farelerinin ventral BLI'si (i) 20 mg / kg'da (ii) posakonazol (Posa) ile 20 gün boyunca tedavi edilmemiş veya tedavi edilmiş; (iii) 100 mg / kg'da benznidazol (BZ) ve (iv) 10 mg / kg'da BZ (n = 6 / grup). Tüm tedaviler günde bir kez gavaj ile oral yoldan uygulandı. Sağdaki grafik: ventral ve dorsal toplam akı ham verilerinin toplamı. Anahtar: ilaç şişesi: tedavi başlangıcı (102 dpi); turuncu çubuk: tedavi sonu (121 dpi); Sarı çubuk ve şırınga simgesi: siklofosfamid enjeksiyonları (131-142. günden itibaren). Turuncu nokta: ex vivo prosedürle analiz edilen fare. ! Fare anestezi sırasında öldü. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66740/66740eq01.jpg" style="margin: auto;"> Fare abdominal anormallikler gösterir. Isı Haritası Ölçeği (Günlük10), düşük seviyeden (3 × 105 mavi) yüksek seviyeye (1 × 107 kırmızı olarak) kadar parlaklık birimindeki biyolüminesans yoğunluğunu gösterir. (C) Dokuda T. cruzi tropizminin ex vivo analizi. 100 mg / kg'da Posa ve BZ ile tedaviden sonra immünosuprese in vivo BLI negatif farelerden veya tedavi edilmemiş ve 10 mg / kg gruplarında BZ'de en düşük sinyale sahip farelerden eksize edilen organların biyolüminesans tespiti. Plaka dağıtım anahtarı şeklin alt kısmında gösterilmiştir (BioRender.com: ZY26LG8AOF ile oluşturulmuştur). Parlaklık ölçeği in vivo panele eşittir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/66740fig05largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
100 mg / kg'da BZ ile tedavi, biyolüminesansı 122 dpi'de eşik seviyelerine (% 93.87 ±% 2.14) düşürdü ve deneyin sonuna kadar ileri sürdü. Ex vivo analiz göz önüne alındığında, BZ %100'lük bir kür oranı elde etti (6/6 fare), çünkü hiçbir fare, bağışıklığı baskılanmış ve iç organlar incelendiğinde bile biyolüminesan sinyalin geri dönüşünü göstermedi. Bu, nüks eksikliği anlamına gelir. Bununla birlikte, daha düşük bir konsantrasyona sahip BZ tedavi rejimi, biyolüminesansta hafif bir azalma (% 85.95 ±% 18.43) ile sonuçlandı, ancak fareler sonraki tüm zaman noktalarında saptanabilir biyolüminesan sinyal odakları göstermeye devam ettiğinden, tedavi olmadı. Bu nedenle, bu model etkisiz tedaviler (posakonazol ve benznidazol ile suboptimal tedavi) ve etkili tedaviler (benznidazol ile optimal dozlama ve tedavi uzunluğu) arasında kantitatif ayrıma izin verir.
Ek Şekil 1: Raportör gen mNeonGreen floresansının ölçümü ile lusiferazın T. cruzi popülasyon ekspresyonunun enfeksiyon öncesi analizi. CL Brener Luc::Neon paraziti tarafından yapısal olarak eksprese edilen mNeonGreen floresan proteininin akış sitometrisi. mNeonGreen floresan yoğunluğu (X ekseni) ile parazit sayısının (Y ekseni) normalleştirilmiş histogramı. Dahili gösterge, analiz edilen gerinim ve formu, floresan medyanını ve floresan popülasyonunun yüzdesini gösterir. Kapı hatları, CL Brener vahşi tip (WT) suşu ile floresan olmayan kontrol olarak tanımlanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/daSilvaetal_Supplemental_Figure%201.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Tablo 1: BLI ölçümünde analiz tablosu örneği. Biyolüminesans görüntülemeden elde edilen ham veriler, Şekil 4B'de gösterilen temsili sonuçlarda kullanılan akut modelde enfeksiyondan sonraki 19. günün nicelemesi. Grup tanımı: Enfekte olmayan fareler olarak kontrol (n = 3/grup); tedavi edilmemiş enfekte fareler olarak araç; 20 gün boyunca 20 mg / kg'da posakonazol (Posa); 20 gün boyunca 100 mg / kg'da benznidazol (BZ); 5 gün boyunca tedavi edilen 100 mg / kg'da BZ (n = 6 / grup). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/daSilvaetal_Supplemental_Table1.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Burada sağlanan protokol, veri toplama, analiz ve yorumlamaya odaklanarak, Trypanosoma cruzi enfeksiyonunun biyolüminesans modelinde ilaç etkinliği çalışmaları gerçekleştirmek için ayrıntılı adımları açıklamaktadır. Teknik sorunları en aza indirmek için sorun giderme ve kalite kontrol prosedürleri de sağlanmaktadır.

To control and decrease the public health impact of human protozoan diseases such as Chagas disease, leishmaniasis, and human African trypanosomiasis, ...

demystifying-vivo-bioluminescence-imaging-chagas-disease-mouse-model

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Demystifying In Vivo Bioluminescence Imaging of a Chagas Disease Mouse Model for Drug Efficacy Studies

837 Görüntüleme.  Universidade de São Paulo. Araştırma grubumuz Chagas hastalığı için ilaç keşfi konusunda çalışmaktadır. Yeni ve daha iyi ilaçlar arıyoruz ve ayrıca parazit olan Trypanosoma cruzi'nin konakçıda nasıl kalabileceğini ve etkili ilaç tedavisinden sonra bile ilaç direnci geliştirmeden hayatta kalabileceğini anlamaya çalışıyoruz. Chagas hastalığı, komplike hastalığın başlangıcından önce başarılı bir şekilde tedavi edilmesi için parazitolojik tedavi ge...