Strand-Specific Analysis of Proteins at Replicating DNA Strands by Enrichment and Sequencing of Protein-Associated Nascent DNA Method

我们的研究重点是表观遗传的机制。具体来说，DNA 复制耦合了亲本组蛋白回收过程，这代表了表观遗传的第一步。研究发现，参与 DNA 复制的多个亲本组蛋白沉积在亲本组蛋白回收中起重要作用。

这包括 D 解旋酶复合物、DNA 聚合酶和保护复合物的复制。传统的遗传和生化方法一直是该研究领域使用的价值。传统上，采用高通量测序方法来了解亲本组蛋白转移过程。

在开发蛋白质相关 DNA 的富集和测序或实验方法之前，研究亲本组蛋白转移过程具有挑战性。实验方法为解决这些基本问题提供了强大的工具。首先，将酵母细胞沉淀锉碎并通过轻轻涡旋重新悬浮。

然后用 0.4 毫升含有蛋白酶抑制剂和抗生素混合物的 CHIP 裂解缓冲液洗涤，以防止细菌污染。将混合物以 5， 000 G 离心 1 分钟。接下来，向沉淀中加入 0.1 毫升含有蛋白酶抑制剂和抗生素混合物的 CHIP 裂解缓冲液。

然后是大约 100 微升的 0.5 毫米玻璃珠。在 4 摄氏度的冷藏室中通过微珠串珠裂解细胞 3 个循环。使用 16 号热针在管底部打孔。

将穿刺的试管嵌套在 1.5 mL 空 DNA 低结合试管中，并在室温下以 1， 600 G 离心 2 分钟，以收集裂解物。小心吸出上清液，不要干扰沉淀。细胞碎片部分将包含染色质。

通过移液 0.35 mL 补充的微球菌核酸酶或 MNase 消化缓冲液来重悬细胞沉淀。接下来，向悬浮液中加入 10 单位的 MNase。倒置 4 到 6 次轻轻混匀，然后在 37 摄氏度的水浴中孵育 20 分钟。

通过添加 5 微升 0.5 摩尔 EDTA 至终浓度为 10 毫摩尔来淬灭 MNase 消化。倒置轻轻混匀，并将试管置于冰上至少 30 分钟。使用 1.5 mL Bioruptor 微管，以高功率对反应混合物进行 3 分钟的超声处理，循环开启 30 秒，关闭 30 秒。

然后，在 4 摄氏度下以 10， 000 G 离心 5 分钟。将上清液转移到新试管中，并在 4 摄氏度下以 10， 000 G 再次离心 10 分钟。然后，收集大约 400 微升的上清液。

保存 30 微升作为 DNA 提取的起始 DNA，并在零下 20 摄氏度下冷冻。使用剩余的 370 μL 细胞裂解物进行组蛋白染色质免疫沉淀。首先，将大约 150 微升先前获得的输入和 H3K4me3 CHIP 样品放在 100 摄氏度的加热块上煮沸 5 分钟，立即将样品在冰上冷却 5 分钟。

然后，将所需量的上述组分添加到样品中。在 4 摄氏度和 10 RPM 的转子上突变样品 2 小时。将混合物转移到含有 20 μL 洗涤蛋白 G 琼脂糖珠的 1.5 mL试管中。

在 4 摄氏度下以 10 RPM 的速度在转子上突变混合物 1 小时。在室温下以 800 G 离心试管 1 分钟。用 1 毫升冷溴脱氧尿嘧啶或 BrdU 免疫沉淀缓冲液洗涤珠子 3 次，每次洗涤旋转 3 分钟。

再次离心试管，用 1 ml TE 缓冲液洗涤 3 分钟。在室温下以 800 G 的离心力再次离心试管 1 分钟，然后小心吸出上清液。向珠子中加入 100 微升含 1% SDS 的 TE 缓冲液。

将混合物在 65 摄氏度下孵育 5 分钟，然后在室温下以 800 G 离心 1 分钟。使用 DNA 纯化柱将上清液纯化到 18 微升洗脱缓冲液中，以获得 BrdU 免疫沉淀和 H3K4me3 eSPAN 样品。按照 ssDNA 和低起始量 DNA 文库制备试剂盒手册，用上述样品制备单链 DNA 文库。

将连接产物纯化到 20 μL 低 EDTA 洗脱缓冲液中。使用来自单链 DNA 文库制备试剂盒的 50 μL 反应混合物扩增 DNA 文库。按照显示的周期，扩增 PCR 混合物。

通过将 PCR 产物与 60 μL 微升微珠混合（预热至 30 摄氏度）来纯化 PCR 产物。彻底混合 PCR 产物和磁珠。让混合物在室温下静置 5 分钟。

将磁珠在磁力架上结合 3 分钟，然后用 200 微升新鲜制备的 80% 乙醇洗涤两次。将磁珠风干 2 分钟，然后将 DNA 稀释到 DNA 文库制备试剂盒中提供的 20 μL 低 EDTA 缓冲液中。使用高分辨率电泳系统测量文库浓度和片段大小分布。

混合等量的单个文库，包括输入 H3K4me3 染色质免疫沉淀、BrdU 免疫沉淀、eSPAN 样品，以进行平行配对末端测序。H3K4me3 eSPAN 的 DNA 测序文库的典型凝胶分析揭示了染色质核小体梯形模式。主单核小体条带出现在 270 个碱基对处，其中接头被添加到从消化获得的 DNA 片段中。

不同的样品映射揭示了野生型和 mcm2-3A 细胞中起始点自主复制序列 607 周围单个核小体的峰值。平均链偏差显示，在野生型酵母细胞中，亲本组蛋白沉积表现出对滞后链的轻微偏倚。然而，在突变的亲本中，组蛋白 H3H4 被转移到前导链。