Strand-Specific Analysis of Proteins at Replicating DNA Strands by Enrichment and Sequencing of Protein-Associated Nascent DNA Method

우리의 연구는 후성유전학적 유전의 메커니즘에 초점을 맞추고 있습니다. 특히, DNA 복제는 후성유전학적 유전의 첫 번째 방출 단계를 나타내는 부모의 히스톤 재활용 과정과 결합되었습니다. DNA 복제에 관여하는 여러 부모 히스톤 증착은 부모 히스톤 재활용에 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었습니다.

여기에는 D 헬리카제 복합체, DNA 중합효소 및 보호 복합체를 위한 복제가 포함됩니다. 전통적인 유전 및 생화학적 접근 방식은 이 연구 분야에서 사용되는 가치였습니다. 전통적으로 부모의 히스톤 전달 과정을 이해하기 위해 고처리량 염기서열분석 방법이 사용되고 있습니다.

단백질 관련 DNA의 농축 및 염기서열분석 또는 실험 방법이 개발되기 전에는 부모의 히스톤 전달 과정을 연구하는 것이 어려웠습니다. 실험 방법은 이러한 근본적인 질문을 해결할 수 있는 강력한 도구를 제공했습니다. 시작하려면 효모 세포 펠릿을 정리하고 부드러운 와류로 다시 현탁시킵니다.

그런 다음 박테리아 오염을 방지하기 위해 프로테아제 억제제와 항생제 혼합물이 포함된 0.4ml의 CHIP 용해 완충액으로 동일하게 세척합니다. 혼합물을 5, 000G에서 1분 동안 원심분리합니다. 다음으로, 프로테아제 억제제와 항생제 혼합물이 포함된 CHIP 용해 완충액 0.1ml를 펠릿에 추가합니다.

그 다음에는 약 100 마이크로 리터의 0.5mm 유리 구슬이 있습니다. 섭씨 4도의 냉장실에서 3주기 동안 비드 비딩으로 세포를 용해합니다. 16게이지 핫 니들을 사용하여 튜브 바닥에 구멍을 뚫습니다.

구멍이 뚫린 튜브를 1.5ml의 빈 DNA Low Binding 튜브에 중첩하여 용해물을 수집하고 실온에서 1, 600G에서 2분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 흡입하십시오. 세포 파편 분획에는 염색질이 포함됩니다.

0.35ml의 Micrococcal nuclease 또는 MNase digestion buffer를 피펫팅하여 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 다음으로, 10단위의 MNase를 서스펜션에 추가합니다. 4-6회 뒤집어서 부드럽게 섞은 다음 섭씨 37도의 수조에서 20분 동안 배양합니다.

10 millimolar의 최종 농도에 5 μlit의 0.5 molar EDTA를 첨가하여 MNase 분해를 담금질합니다. 반전으로 부드럽게 섞고 튜브를 얼음 위에 최소 30분 동안 놓습니다. 1.5 밀리리터 Bioruptor 마이크로튜브를 사용하여 30초 켜기 및 30초 끄기 주기로 3분 동안 고출력으로 반응 혼합물을 초음파 처리합니다.

그런 다음 섭씨 4도에서 5분 동안 10, 000G에서 원심분리기를 합니다. 새로운 관으로 상등액을 옮기고 10, 4 섭씨 온도에 10 분 동안 000 G에 다시 분리기를 옮긴다. 그런 다음 약 400마이크로리터의 상층액을 수집합니다.

DNA 추출을 위해 30마이크로리터를 입력 DNA로 저장하고 섭씨 영하 20도에서 동결합니다. 히스톤 염색질 면역침전을 위해 나머지 370마이크로리터의 세포 용해물을 사용합니다. 시작하려면 이전에 얻은 입력 및 H3K4me3 CHIP 샘플 약 150마이크로리터를 섭씨 100도의 열 블록에서 5분 동안 끓인 후 즉시 얼음에서 샘플을 5분 동안 냉각합니다.

그런 다음 언급된 성분을 필요한 양만큼 샘플에 추가합니다. 섭씨 4도 및 10RPM의 로터에서 2시간 동안 샘플을 돌연변이시킵니다. 혼합물을 세척된 단백질 G 세파로스 비드 20마이크로리터가 들어 있는 1.5ml 튜브로 옮깁니다.

10RPM의 로터에서 섭씨 4도에서 1시간 동안 혼합물을 돌연변이시킵니다. 800G의 실온에서 1분 동안 튜브를 돌립니다. 1ml의 차가운 Bromo-deoxyuridine 또는 BrdU 면역침전 완충액으로 비드를 3회 세척합니다.

튜브를 다시 원심분리하고 1ml의 TE 버퍼로 3분 동안 세척합니다. 실온에서 800G에서 1분간 튜브를 다시 돌리고 상층액을 조심스럽게 흡입합니다. 비드에 1%SDS가 포함된 100마이크로리터의 TE 버퍼를 추가합니다.

혼합물을 섭씨 65도에서 5분 동안 배양한 다음 실온에서 1분 동안 800G에서 회전시킵니다. DNA 정제 컬럼을 사용하여 상등액을 18마이크로리터의 용리 완충액으로 정제하여 BrdU 면역침전 및 H3K4me3 eSPAN 샘플을 얻습니다. ssDNA 및 저입력 DNA 라이브러리 준비 키트 설명서에 따라 언급된 샘플로 단일 가닥 DNA 라이브러리를 준비합니다.

결찰 생성물을 20마이크로리터의 낮은 EDTA 용리 완충액으로 정제합니다. 단일 가닥 DNA 라이브러리 준비 키트에서 50마이크로리터의 반응 혼합물을 사용하여 DNA 라이브러리를 증폭합니다. 표시된 주기에 따라 PCR 혼합물을 증폭합니다.

PCR 산물을 섭씨 30도로 예열된 60마이크로리터의 비드와 혼합하여 정제합니다. PCR 산물과 비드를 철저히 혼합합니다. 혼합물을 실온에서 5분 동안 그대로 두십시오.

마그네틱 스탠드에 구슬을 3 분 동안 묶고 갓 준비한 80 % 에탄올 200 마이크로 리터로 두 번 씻습니다. 비드를 2분 동안 자연 건조하고 DNA를 DNA 라이브러리 준비 키트에 제공된 20마이크로리터의 낮은 EDTA 완충액으로 희석합니다. 고분해능 전기영동 시스템을 사용하여 라이브러리 농도 및 단편 크기 분포를 측정합니다.

입력 H3K4me3 염색질 면역침전, BrdU 면역침전, eSPAN 샘플을 포함한 개별 라이브러리를 동일한 양으로 풀링하여 병렬 쌍 말단 염기서열분석을 수행합니다. H3K4me3 eSPAN의 DNA 염기서열분석 라이브러리의 일반적인 겔 분석에서 염색질 뉴클레오솜 래더 패턴이 밝혀졌습니다. 주요 단핵소체 띠는 270개의 염기쌍에서 나타났으며, 여기서 접합체는 분해에서 얻은 DNA 단편에 추가되었습니다.

서로 다른 샘플 매핑은 기원을 둘러싼 개별 뉴클레오솜에서 피크를 보여주었고, 야생형 및 mcm2-3A 세포에서 서열 607을 자율적으로 복제했습니다. 평균 가닥 편향은 야생형 효모 세포에서 부모의 히스톤 침착이 지연 가닥에 대해 약간의 편향을 나타냈다는 것을 보여주었습니다. 그러나 돌연변이 부모에서 히스톤 H3H4는 선행 가닥으로 전달되었습니다.