使用两种贴壁细胞系的共培养模型

正如我们机构的名称，母胎医学研究所所暗示，我们的研究主要集中在女性生殖生物学上。我们的目标是了解生殖障碍的机制并确定治疗它们的潜在靶点。这种方法的一个关键优点是与市售的共培养系统相比，大大减少了时间和支出。

自制脚手架由现成的材料制成，大大降低了安装成本。这种多细胞体外模型更好地代表了植入区域的复杂体内解剖结构。未来，我们实验室将把其他细胞类型引入这种混合接种多细胞体外模型，并更多地研究子宫植入研究和子宫功能在子宫内膜损伤和宫内粘附等疾病发病机制中的作用。

首先，获取用于模型构建的 3D 打印脚手架。对于细胞培养，将干净无菌的 18 毫米方形盖玻片放在 12 孔板的底部。用 200 μL 浓度为 200 至 300 μg/mL 的细胞外基质涂覆盖玻片。

将板保持在 37 摄氏度 1 小时。然后从板中取出细胞外基质。接下来，在显微镜下检查先前培养的人胚胎干细胞和 Ishikawa 细胞，以确认适当的汇合。

然后从孔中取出用过的培养基，用 3 毫升 PBS 洗涤细胞两次。现在将细胞与 2 毫升解离酶在 37 摄氏度下孵育 2 分钟以分离它们。使用完全培养基中和反应。

然后通过上下移液来制备单细胞悬液。现在将 100 μL 细胞悬液与台盼蓝混合，保持稀释因子为 2。然后将盖玻片滑过血细胞计数器腔室。

用混合了台盼蓝的细胞悬液填充两个侧腔。在 20 倍显微镜下计数两侧正方形的细胞数，并根据计数计算细胞密度。现在将浓度为 10 到 5 个细胞/毫升的人胚胎干细胞接种在含有新鲜培养基的准备好的板中，并在 37 摄氏度下与 5% 二氧化碳孵育 24 小时。

对于 Ishikawa 细胞系，第二天将细胞接种到没有盖玻片的孔中。用乙醇和双蒸水彻底浸泡支架两天。浸泡后，取出双蒸水，密封金属罐。

然后使用 121 摄氏度的高压灭菌器对支架进行消毒。之后，让它们晾干。向含有 Ishikawa 细胞的孔中加入大约 2 毫升的补充培养基。

将带有附着的人胚胎干细胞的盖玻片转移到支架上，将细胞面朝下放置。将支架插入含有 Ishikawa 细胞的孔中。对于第二种设置，将带有 Ishikawa 细胞的盖玻片放在支架上，并将其插入含有胚胎干细胞的孔中。

在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育共培养系统。小心地从孔中取出培养基，然后用无菌 PBS 轻轻冲洗细胞。使用细镊子或镊子，从培养皿中取出带有附着细胞的盖玻片。

或者，将盖玻片放入装有 PBS 的新培养皿中，以在转移过程中保持水分。在干净的显微镜载玻片上加入一滴 PBS，然后将含有细胞的盖玻片轻轻转移到液滴上，确保细胞面朝下放在载玻片上。将准备好的载玻片放在倒置显微镜的载物台上。

选择合适的物镜，并使用粗调和微调调焦旋钮调整焦距。设置显微镜参数，包括照明强度和相机设置。使用显微镜软件以所需的放大倍率和视场捕获图像。

72 小时后，两种细胞类型的密度在共培养条件下仍然很低，而独立培养的细胞密度显著增加。共培养的人胚胎干细胞的长度比独立培养的短。