Como sugiere el nombre de nuestra institución, el Instituto de Medicina Materno-Fetal, nuestra investigación se centra principalmente en la biología reproductiva femenina. Nuestro objetivo es comprender el mecanismo de los trastornos reproductivos e identificar posibles objetivos para tratarlos. Una ventaja clave de este enfoque es la reducción sustancial de tiempo y gastos en comparación con los sistemas de cocultivo disponibles comercialmente.
El andamio casero está construido con materiales fácilmente disponibles, lo que reduce significativamente el costo de la instalación. Estos modelos in vitro multicelulares representan mejor una anatomía in vivo compleja de la región de implantación. En el futuro, nuestro laboratorio introducirá otros tipos de células en este modelo in vitro multicelular de siembra mixta, e investigará más tanto en estudios de implantación como en la función uterina en la patogénesis de enfermedades como la lesión endometrial y la adherencia intrauterina.
Para empezar, consigue el andamio impreso en 3D para la construcción del modelo. Para el cultivo celular, coloque un cubreobjetos cuadrado limpio y estéril de 18 milímetros en el fondo de una placa de 12 pocillos. Cubra el cubreobjetos con 200 microlitros de matriz extracelular a una concentración de 200 a 300 microgramos por mililitro.
Mantenga el plato a 37 grados centígrados durante una hora. A continuación, retire la matriz extracelular de la placa. A continuación, inspeccione las células madre embrionarias humanas y las células de Ishikawa previamente cultivadas bajo un microscopio para confirmar la confluencia adecuada.
Luego retire el medio gastado de los pocillos y lave las celdas dos veces con tres mililitros de PBS. Ahora incuba las células con dos mililitros de enzima de disociación a 37 grados centígrados durante dos minutos para desprenderlas. Neutralizar la reacción utilizando un medio de cultivo completo.
A continuación, cree una suspensión de una sola célula pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Ahora mezcle 100 microlitros de la suspensión celular con azul de tripán, manteniendo un factor de dilución de dos. A continuación, deslice el cubreobjetos sobre la cámara del hemocitómetro.
Llene ambas cámaras laterales con la suspensión de celdas mezclada con azul de tripán. Cuente el número de células en cuadrados a ambos lados con un microscopio 20X y calcule la densidad de células en función de los recuentos. Ahora siembre las células madre embrionarias humanas a una concentración de 10 a la potencia de cinco células por mililitro en la placa preparada que contiene medio fresco, e incube a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 24 horas.
Para la línea celular de Ishikawa, siembre las células en el pocillo sin un cubreobjetos al día siguiente. Remoje bien los andamios con alcohol etílico y agua destilada doble durante dos días. Después de remojar, retire el agua destilada doble y selle la lata de metal.
A continuación, esterilice los andamios con un autoclave a 121 grados centígrados. Después de eso, déjalos secar. Agregue aproximadamente dos mililitros de medio complementario al pocillo con las celdas de Ishikawa.
Transfiera el cubreobjetos con células madre embrionarias humanas adjuntas al andamio, colocando la célula con el lado hacia abajo. Conecte el andamio al pozo que contiene las celdas de Ishikawa. Para la segunda configuración, coloque el cubreobjetos con células de Ishikawa en el andamio y conéctelo al pozo que contiene células madre embrionarias.
Incubar los sistemas de cocultivo a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Retire con cuidado el medio de cultivo de los pocillos y enjuague suavemente las células con PBS estéril. Con pinzas finas o pinzas, retire los cubreobjetos con células adheridas de las placas de cultivo.
Opcionalmente, coloque los cubreobjetos en un plato nuevo con PBS para mantenerlos hidratados durante el proceso de transferencia. Agregue una gota de PBS en un portaobjetos de microscopio limpio y transfiera suavemente el cubreobjetos que contiene las células a la gota, asegurándose de que las células estén boca abajo sobre el portaobjetos. Coloque el portaobjetos preparado en la platina de un microscopio invertido.
Seleccione la lente del objetivo adecuada y use las perillas de enfoque grueso y fino para ajustar el enfoque. Establezca los parámetros del microscopio, incluida la intensidad de la iluminación y la configuración de la cámara. Utilice el software del microscopio para capturar imágenes con los aumentos y campos de visión deseados.
La densidad de ambos tipos de células permaneció baja en la condición de cocultivo después de 72 horas, mientras que las densidades de células cultivadas de forma independiente aumentaron significativamente. La longitud de las células madre embrionarias humanas cocultivadas fue más corta que la de las cultivadas de forma independiente.
