使用 2D-TAU 凝胶电泳揭示组蛋白蛋白形式

我们目前的工作重点是更好地表征表观遗传变化和代谢重新布线之间的现有相关性，最终目标是确定新的表观遗传治疗靶点。鉴于表观遗传修饰的动态性和可逆性，最近已经开发了几种表观药物，导致癌症治疗的改善和化疗耐药性的降低。最近，由于现代质谱法的应用以及分离技术，如首页或高效液相色谱法，实例表征领域取得了重大进展。

组蛋白表征的主要挑战是，存在不可计数的组蛋白蛋白形式，这是由动态修饰酶和代谢物可用性之间的串扰引起的。首先为小型垂直聚丙烯酰胺凝胶、电泳系统制备小型 TAU 凝胶。为此，在室温下轻轻搅拌，将六摩尔尿素溶解在 15% 丙烯酰胺双丙烯酰胺溶液和 1 毫升超纯水中。

然后添加其他组件并调整音量。用这种溶液填充预设的凝胶板，确保没有气泡形成，并从顶部留出 1.5 厘米。在上面添加 1 毫升异丙醇以使凝胶变平。

为了制备浓缩胶溶解剂，将尿素溶解在 6% 丙烯酰胺、双丙烯酰胺和一毫升超纯水中。添加其他组分后，用这种溶液填充凝胶板，并在板之间插入一个 10 孔梳子，直到溶液到达梳齿的一半。接下来溶解 6 摩尔尿素、5% 冰醋酸和双蒸水，制备 100 微升 TAU 样品缓冲液。

然后将冻干的组蛋白样品溶解在 30 μL TAU 样品缓冲液中。用终浓度为 5% 乙酸的 TAU 电泳缓冲液填充迷你盒。使用注射器用电泳缓冲液冲洗凝胶的孔，然后用微量移液器将样品加载到孔中。

然后将电泳室连接到电源，将正极放在底部。偶尔，关闭电源并用注射器冲洗凝胶孔，以去除凝胶底面上的气泡。从凝胶板中取出凝胶后，使用干净的手术刀切割感兴趣的泳道。

现在用 15 mL 0.5 M tris hydrochloride （pH 8.8） 洗涤凝胶泳道 15 分钟。使用此处显示的组分准备 15 毫升平衡缓冲液 1 和 2。然后将平衡缓冲液 2 储存在黑暗中。

现在，将凝胶泳道放入 10 mL 平衡缓冲液 1 中孵育 15 分钟，轻轻搅拌，然后倾析。之后，将凝胶泳道放入 10 mL 平衡缓冲液 2 中，在黑暗中轻轻搅拌孵育 15 分钟，然后倾析。接下来，使用此处显示的组合物制备 15% 丙烯酰胺分离凝胶。

设置凝胶板并用分离凝胶溶液填充，在距长凝胶板末端留出 1.5 厘米的距离。在上面添加 1 毫升异丙醇以使凝胶变平并使其聚合。凝胶聚合后，倒出异丙醇并使用 3 mm 纤维素色谱纸干燥孔。

将切割的凝胶泳道插入分离凝胶孔中，使用镊子防止气泡，然后使用 0.5% 低熔点琼脂糖的 tris 甘氨酸和 SDS 缓冲液，以及 5 微升 0.003% 溴酚蓝，将凝胶泳道密封到分离凝胶上。将凝胶板放入凝胶盒中，并用 tris 甘氨酸和 SDS 缓冲液填充。在 120 伏特下运行凝胶，直到溴酚蓝染料到达底部。

运行后，轻轻地从板中取出凝胶并丢弃多余的琼脂糖。首先，对组蛋白样品进行小型 2D 凝胶氚酸尿素或 TAU 电泳，然后进行银染。然后准备此处所示的试剂。

使用干净的手术刀，从染色的凝胶中切除感兴趣的组蛋白点，并将每个点放入新鲜的 1.5 毫升硅管中，以避免异构体交叉污染。向每个凝胶点添加 250 微升 50 毫摩尔碳酸氢铵或 50% 丙酮硝基，并在室温下在热混合器中轻轻搅拌孵育。倒出溶液并重复此过程 3 次，直到凝胶块呈透明状。

要使凝胶斑点脱水，请添加 200 微升丙酮硝基。在此步骤中，凝胶块将变为不透明的白色。倒出丙酮丁腈，让凝胶斑点风干 10 分钟。

凝胶块在试管中会显得干燥。接下来，通过添加 20 微升胰蛋白酶溶液或足够体积的胰蛋白酶溶液来覆盖凝胶块，使凝胶斑点再水化。将试管在 37 摄氏度的热混合器中轻轻搅拌孵育至少 4 小时，最多 16 小时。

将含有三联肽的上清液转移到新管中。向凝胶块中加入 50 μL 提取溶液，并在 4 摄氏度下在超声波水浴中超声处理 10 分钟两次。将含有额外三联肽的上清液转移到同一个新试管中。

使用冻干机在 30 摄氏度下干燥混合提取的肽。冻干颗粒将在试管中形成。现在，向每个试管中加入 15 微升 0.1% 三氟乙酸，并在 25 摄氏度的热混合器中轻轻孵育。

将上清液转移至样品瓶中，进行液相色谱串联、质谱分析。