Çabalarımız şu anda epigenetik değişiklikler ve metabolik yeniden kablolama arasındaki mevcut korelasyonu daha iyi karakterize etmeye odaklanmıştır ve nihai hedef yeni epigenetik terapötik hedefleri belirlemektir. Epigenetik modifikasyonun dinamik ve geri dönüşümlü doğası göz önüne alındığında, son zamanlarda, kanser tedavisinin iyileşmesine ve kemoterapi direncinin azalmasına yol açan birkaç epi-ilaç ajanı geliştirilmiştir. Son zamanlarda, modern kütle spektometrisinin uygulanmasının yanı sıra üst sayfa veya yüksek performanslı sıvı kromatografisi gibi ayırma teknikleri sayesinde örnek karakterizasyonları alanında önemli ilerlemeler kaydedilmiştir.
Histon karakterizasyonundaki ana zorluk, dinamik modifiye enzim ve metabolitlerin kullanılabilirliği arasındaki karışmadan kaynaklanan sayılamayan histon proteoformlarının varlığıdır. Mini dikey poliakrilamid jel, elektroforez sistemi için mini bir TAU jeli hazırlayarak başlayın. Bunu yapmak için, altı molar üreyi %15 akrilamid bis-akrilamid çözeltisi ve bir mililitre ultra saf su içinde oda sıcaklığında hafif çalkalama altında çözün.
Ardından diğer bileşenleri ekleyin ve ses seviyesini ayarlayın. Önceden ayarlanmış jel plakalarını bu solüsyonla doldurun, hava kabarcığı oluşmadığından emin olun ve üstten 1,5 santimetre uzakta bırakın. Jeli düzleştirmek için üstüne bir mililitre izopropanol ekleyin.
İstifleme jeli çözünmesini hazırlamak için, üreyi bir mililitre ultra saf su ile %6 akrilamid, bis-akrilamid içinde çözün. Diğer bileşenleri ekledikten sonra, jel plakalarını bu solüsyonla doldurun ve solüsyon tarağın dişlerinin yarısına ulaşana kadar plakalar arasına 10 kuyulu bir tarak yerleştirin. Daha sonra, 100 mikrolitre TAU numune tamponu hazırlamak için altı molar üre, %5 buzlu asetik asit ve çift damıtılmış suyu çözün.
Daha sonra liyofilize histon örneğini 30 mikrolitre TAU örnek tamponu içinde çözün. Mini kaseti, nihai konsantrasyonu %5 asetik asit olan TAU çalışma tamponu ile doldurun. Jelin kuyucuklarını çalışan tamponla durulamak için bir şırınga kullanın ve numuneyi bir mikro pipetle kuyucuklara yükleyin.
Ardından elektroforez odasını güç kaynağına bağlayın ve pozitif elektrodu tabana yerleştirin. Bazen, güç kaynağını kapatın ve jelin alt yüzeyindeki kabarcıkları gidermek için jel kuyularını bir şırınga ile durulayın. Jeli jel plakalardan çıkardıktan sonra, temiz bir neşter kullanarak ilgilenilen şeridi kesin.
Şimdi jel şeridini 15 mililitre 0,5 M tris hidroklorür, pH 8,8 ile 15 dakika yıkayın. Burada gösterilen bileşenleri kullanarak 15 mililitre denge tamponu bir ve iki hazırlayın. Ardından denge tamponu ikisini karanlıkta saklayın.
Şimdi, jel şeridini 10 mililitre dengeleme tamponunda 15 dakika boyunca hafif çalkalama ile inkübe edin, ardından boşaltın. Bundan sonra, jel şeridini boşaltmadan önce karanlıkta 15 dakika boyunca hafif çalkalama altında 10 mililitre dengeleme tamponu ikide inkübe edin. Ardından, burada gösterilen bileşimi kullanarak %15'lik bir akrilamid çözme jeli hazırlayın.
Jel plakasını ayarlayın ve uzun jel plakanın ucundan 1,5 santimetre uzakta bırakarak çözülen jel solüsyonu ile doldurun. Jeli düzleştirmek ve polimerize olmasına izin vermek için üstüne bir mililitre izopropanol ekleyin. Jel polimerize olduktan sonra, izopropanolü boşaltın ve üç mm selüloz kromatografi kağıdı kullanarak kuyuyu kurutun.
Kesilmiş jel şeridini, hava kabarcıklarını önlemek için cımbız kullanarak çözme jeli kuyusuna yerleştirin, ardından beş mikrolitre %0.003 bromofenol mavisi ile tris glisin ve SDS tamponunda %0.5 düşük erime noktalı agaroz kullanarak jel şeridini çözme jeline kapatın. Jel plakalarını kasete yerleştirin ve üzerlerini tris glisin ve SDS tamponu ile doldurun. Bromofenol mavisi boya dibe ulaşana kadar jeli 120 voltta çalıştırın.
Çalıştırdıktan sonra, jeli plakalardan yavaşça çıkarın ve fazla agarozu atın. Başlamak için, histon numuneleri üzerinde mini 2D jel triton asit üre veya TAU elektroforezi gerçekleştirin ve ardından gümüş boyama yapın. Ardından burada gösterilen reaktifleri hazırlayın.
Temiz bir neşter kullanarak, lekeli jelden ilgilenilen histon lekelerini kesin ve izoform çapraz kontaminasyonunu önlemek için her noktayı taze, 1,5 mililitrelik bir silikon tüpe yerleştirin. Her jel noktasına 250 mikrolitre 50 milimolar amonyum bikarbonat veya% 50 aseton nitro ekleyin ve oda sıcaklığında bir termo karıştırıcıda hafif çalkalama altında inkübe edin. Solüsyonu boşaltın ve jel parçaları şeffaf görünene kadar bu işlemi üç kez tekrarlayın.
Jel lekelerini kurutmak için 200 mikrolitre aseton nitrol ekleyin. Bu adım sırasında jel parçaları opak beyaza dönecektir. Aseton nitrili boşaltın ve jel lekelerinin 10 dakika kurumasını bekleyin.
Jel parçaları tüplerde kuru görünecektir. Daha sonra, 20 mikrolitre tripsin çözeltisi veya jel parçalarını kaplamak için yeterli hacim ekleyerek jel lekelerini yeniden sulandırın. Tüpleri bir termo karıştırıcıda 37 santigrat derecede hafif çalkalama altında en az dört saat ve 16 saate kadar inkübe edin.
Triptik peptitleri içeren süpernatanı taze bir tüpe aktarın. Jel parçalarına 50 mikrolitre ekstraksiyon çözeltisi ekleyin ve ultrasonik su banyosunda dört santigrat derecede 10 dakika boyunca iki kez sonikat yapın. Ek triptik peptitleri içeren süpernatanı aynı taze tüpe aktarın.
Havuzlanmış ekstrakte edilmiş peptitleri 30 santigrat derecede kurutmak için bir liyofilizatör kullanın. Tüpte liyofilize bir pelet oluşacaktır. Şimdi, her tüpe 15 mikrolitre% 0.1 trifloroasetik asit ekleyin ve 25 santigrat derecede bir termo karıştırıcıda hafifçe inkübe edin.
Sıvı kromatografi tandem, kütle spektrometresi analizi için süpernatanı bir şişeye aktarın.
