Nossos esforços estão atualmente focados em caracterizar melhor a correlação existente entre mudanças epigenéticas e religação metabólica, com o objetivo final de identificar novos alvos terapêuticos epigenéticos. Dada a natureza dinâmica e reversível da modificação epigenética, recentemente, vários agentes epi-drogas foram desenvolvidos, levando à melhoria do tratamento do câncer e à redução da resistência à quimioterapia. Recentemente, progressos significativos foram feitos no campo das caracterizações de instâncias, graças à aplicação da moderna espectrometria de massas, juntamente com as técnicas de separação, como a cromatografia líquida de alta eficiência.
O principal desafio na caracterização de histonas é a existência de inúmeras proteoformas de histonas, resultantes do crosstalk entre enzimas modificadas dinâmicas e disponibilidade de metabólitos. Comece preparando um mini gel TAU para um mini gel de poliacrilamida vertical, sistema de eletroforese. Para fazer isso, dissolva seis molares de uréia em uma solução de 15% de acrilamida bis-acrilamida e um mililitro de água ultrapura sob agitação suave à temperatura ambiente.
Em seguida, adicione os outros componentes e ajuste o volume. Encha as placas de gel predefinidas com esta solução, garantindo que não se formem bolhas de ar e deixando 1,5 centímetros do topo. Adicione um mililitro de isopropanol por cima para nivelar o gel.
Para preparar a dissolução do gel de empilhamento, dissolva a uréia em uma bi-acrilamida a 6% com um mililitro de água ultrapura. Depois de adicionar os outros componentes, encha as placas de gel com esta solução e insira um pente de 10 poços entre as placas até que a solução atinja a metade dos dentes do pente. Em seguida, dissolva seis molares de ureia, ácido acético glacial a 5% e água duplamente destilada para preparar 100 microlitros de tampão de amostra TAU.
Em seguida, dissolva a amostra de histona liofilizada em 30 microlitros de tampão de amostra TAU. Encha o mini com tampão de corrida TAU com uma concentração final de 5% de ácido acético. Use uma seringa para enxaguar os poços do gel com tampão corrido e carregue a amostra nos poços com uma micropipeta.
Em seguida, conecte a câmara de eletroforese à fonte de alimentação, colocando o eletrodo positivo na parte inferior. Ocasionalmente, desligue a fonte de alimentação e enxágue os poços de gel com uma seringa para remover as bolhas da superfície inferior do gel. Depois de remover o gel das placas de gel, corte a faixa de interesse, usando um bisturi limpo.
Agora lave a pista de gel com 15 mililitros de cloridrato de tris 0,5 M, pH 8,8 por 15 minutos. Prepare 15 mililitros de tampão de equilíbrio um e dois, usando os componentes mostrados aqui. Em seguida, armazene o buffer de equilíbrio dois no escuro.
Agora, incube a pista de gel em 10 mililitros de tampão de equilíbrio um com agitação suave por 15 minutos e depois transvase. Depois disso, incube a pista de gel em 10 mililitros de tampão de equilíbrio dois sob agitação suave por 15 minutos no escuro antes de decantar. Em seguida, prepare um gel de resolução de acrilamida a 15%, usando a composição mostrada aqui.
Configure a placa de gel e encha-a com a solução de gel de resolução, deixando 1,5 centímetros da extremidade da placa de gel longa. Adicione um mililitro de isopropanol por cima para nivelar o gel e deixá-lo polimerizar. Uma vez polimerizado o gel, decantar o isopropanol e secar o poço, utilizando papel para cromatografia de celulose de três mm.
Insira a faixa de gel cortada no gel de resolução, usando uma pinça para evitar bolhas de ar, em seguida, sele a faixa de gel no gel de resolução, usando agarose de baixo ponto de fusão a 0,5% em tris glicina e tampão SDS, com cinco microlitros de azul de bromofenol de 0,003%. Coloque as placas de gel no e encha-as com tris glicina e tampão SDS. Execute o gel a 120 volts até que o corante azul de bromofenol atinja o fundo.
Após a execução, remova suavemente o gel das placas e descarte o excesso de agarose. Para começar, execute mini ureia de ácido triton em gel 2D ou eletroforese TAU em amostras de histonas, seguida de coloração com prata. Em seguida, prepare os reagentes mostrados aqui.
Usando um bisturi limpo, retire os pontos de interesse das histonas do gel corado e coloque cada ponto em um tubo de silício fresco de 1,5 mililitro para evitar a contaminação cruzada da isoforma. Adicione 250 microlitros de bicarbonato de amônio 50 milimolar ou 50% de acetona nitro a cada ponto de gel e incube sob agitação suave em um misturador térmico à temperatura ambiente. Transvase a solução e repita este processo três vezes até que os pedaços de gel pareçam transparentes.
Para desidratar as manchas de gel, adicione 200 microlitros de acetona nitrol. Durante esta etapa, os pedaços de gel ficarão brancos opacos. Transvase a acetona nitrilo e deixe as manchas de gel secarem ao ar por 10 minutos.
Os pedaços de gel parecerão secos nos tubos. Em seguida, reidratar as manchas de gel adicionando 20 microlitros de solução de tripsina ou volume suficiente para cobrir os pedaços de gel. Incube os tubos em um misturador térmico a 37 graus Celsius sob agitação suave por pelo menos quatro horas e até 16 horas.
Transfira o sobrenadante, contendo os peptídeos trípticos, para um novo tubo. Adicione 50 microlitros de solução de extração às peças de gel e sonice duas vezes em banho-maria ultrassônico por 10 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o sobrenadante, contendo os peptídeos trípticos adicionais para o mesmo tubo fresco.
Use um liofilizador para secar os peptídeos extraídos agrupados a 30 graus Celsius. Um pellet liofilizado se formará no tubo. Agora, adicione 15 microlitros de ácido trifluoroacético a 0,1% a cada tubo e incube suavemente em um misturador térmico a 25 graus Celsius.
Transferir o sobrenadante para um frasco para injetáveis para análise por cromatografia líquida em conjunto e espectrometria de massa.
