Nuestros esfuerzos se centran actualmente en caracterizar mejor la correlación existente entre los cambios epigenéticos y el recableado metabólico, con el objetivo final de identificar nuevas dianas terapéuticas epigenéticas. Dada la dinámica y la naturaleza reversible de la modificación epigenética, recientemente se han desarrollado varios agentes epifármacos, lo que ha llevado a la mejora del tratamiento del cáncer y a la reducción de la resistencia a la quimioterapia. Recientemente, se han producido avances significativos en el campo de la caracterización de instancias, gracias a la aplicación de la espectrometría de masas moderna, junto con las técnicas de separación, como la cromatografía líquida de alta resolución o la primera página.
El principal desafío en la caracterización de histonas es la existencia de innumerables proteoformas de histonas, resultantes de la diafonía entre la enzima modificada dinámicamente y la disponibilidad de metabolitos. Comience preparando un mini gel de TAU para un mini gel de poliacrilamida vertical, sistema de electroforesis. Para ello, disuelva seis molares de urea en una solución de bis-acrilamida al 15% y un mililitro de agua ultrapura bajo una agitación suave a temperatura ambiente.
A continuación, añade los demás componentes y ajusta el volumen. Llene las placas de gel preestablecidas con esta solución, asegurándose de que no se formen burbujas de aire y dejando a 1,5 centímetros de la parte superior. Añade un mililitro de isopropanol encima para nivelar el gel.
Para preparar el gel de apilamiento se disuelve, disuelva la urea en un 6% de acrilamida, bis-acrilamida con un mililitro de agua ultrapura. Después de agregar los otros componentes, llene las placas de gel con esta solución e inserte un peine de 10 pocillos entre las placas hasta que la solución llegue a la mitad de los dientes del peine. A continuación, disuelva seis molares de urea, ácido acético glacial al 5% y agua destilada doble para preparar 100 microlitros de tampón de muestra de TAU.
A continuación, disuelva la muestra de histonas liofilizada en 30 microlitros de tampón de muestra TAU. Llene el mini casete con tampón de funcionamiento TAU con una concentración final de 5% de ácido acético. Utilice una jeringa para enjuagar los pocillos del gel con tampón corriente y cargue la muestra en los pocillos con una micropipeta.
A continuación, conecte la cámara de electroforesis a la fuente de alimentación, colocando el electrodo positivo en la parte inferior. De vez en cuando, apague la fuente de alimentación y enjuague los pocillos de gel con una jeringa para eliminar las burbujas de la superficie inferior del gel. Después de quitar el gel de las placas de gel, corte el carril de interés, usando un bisturí limpio.
Ahora lave el carril de gel con 15 mililitros de clorhidrato de tris 0,5 M, pH 8,8 durante 15 minutos. Prepare 15 mililitros de tampón de equilibrio uno y dos, utilizando los componentes que se muestran aquí. A continuación, guarde el búfer de equilibrio dos en la oscuridad.
Ahora, incubar el carril de gel en 10 mililitros de tampón de equilibrio con agitación suave durante 15 minutos, luego decantar. Después de eso, incubar el carril de gel en 10 mililitros de tampón de equilibrio dos bajo agitación suave durante 15 minutos en la oscuridad antes de decantarlo. A continuación, prepare un gel resolutivo de acrilamida al 15%, utilizando la composición que se muestra aquí.
Coloque la placa de gel y llénela con la solución de gel resolutivo, dejando 1,5 centímetros del extremo de la placa de gel larga. Agregue un mililitro de isopropanol encima para nivelar el gel y permitir que se polimerice. Una vez polimerizado el gel, decantar el isopropanol y secar el pocillo, utilizando papel de cromatografía de celulosa de tres mm.
Inserte el carril de gel cortado en el pozo de gel de resolución, usando pinzas para evitar burbujas de aire, luego selle el carril de gel al gel de resolución, usando agarosa de bajo punto de fusión al 0.5% en tris glicina y tampón SDS, con cinco microlitros de azul de bromofenol al 0.003%. Coloque las placas de gel en el casete y llénelas con tris glicina y tampón SDS. Enciende el gel a 120 voltios hasta que el tinte azul de bromofenol llegue al fondo.
Después de correr, retire suavemente el gel de las placas y deseche el exceso de agarosa. Para comenzar, realice una mini electroforesis de urea ácida tritón en gel 2D, o electroforesis TAU en muestras de histonas, seguida de tinción con plata. A continuación, prepare los reactivos que se muestran aquí.
Con un bisturí limpio, extirpe las manchas de histonas de interés del gel teñido y coloque cada mancha en un tubo de silicona fresco de 1,5 mililitros para evitar la contaminación cruzada de las isoformas. Agregue 250 microlitros de bicarbonato de amonio de 50 milimolares o nitro de acetona al 50% a cada punto de gel e incube bajo agitación suave en un termomezclador a temperatura ambiente. Decanta la solución y repite este proceso tres veces hasta que los trozos de gel parezcan transparentes.
Para deshidratar las manchas de gel, añade 200 microlitros de nitrol de acetona. Durante este paso, las piezas de gel se volverán de color blanco opaco. Decanta el nitrilo de acetona y deja que las manchas de gel se sequen al aire durante 10 minutos.
Las piezas de gel aparecerán secas en los tubos. A continuación, rehidrata las manchas de gel añadiendo 20 microlitros de solución de tripsina o volumen suficiente para cubrir las piezas de gel. Incubar los tubos en un termomezclador a 37 grados centígrados bajo una agitación suave durante al menos cuatro horas y hasta 16 horas.
Transfiera el sobrenadante, que contiene los péptidos trípticos, a un tubo nuevo. Añadir 50 microlitros de solución de extracción a las piezas de gel y sonicar dos veces en un baño de agua ultrasónico durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante, que contiene los péptidos trípticos adicionales, al mismo tubo fresco.
Utilice un liofilizador para secar los péptidos extraídos agrupados a 30 grados centígrados. Se formará una bolita liofilizada en el tubo. Ahora, agregue 15 microlitros de ácido trifluoroacético al 0,1% a cada tubo e incube suavemente en un termomezclador a 25 grados centígrados.
Transfiera el sobrenadante a un vial para cromatografía líquida en tándem, análisis de espectrometría de masas.
