通过体外泛素链切割测定法测量神经发育障碍相关去泛素化酶的酶活性

我们感兴趣的是定义与泛素系统酶中的基因变异相关的神经发育障碍的分子基础。我们使用尖端技术来剖析这些酶控制的信号通路，并确定基因变异对蛋白质生物学的影响。这种方法的优点是它是一种独立于底物的技术，不需要事先了解由特定 DUB 调节的底物。

通过这种方式，我们可以直接测量神经发育障碍相关基因变异对 DUB 催化活性的影响，并提出可能的致病机制。由于对大多数 DUB 的细胞功能知之甚少，因此我们的实验室重点将放在确定这些酶介导的信号通路以及与遗传疾病相关的基因变异如何影响这些过程上。首先，在使用前立即在冰上解冻 20 微升化学感受态 Rosetta 2 大肠杆菌细胞。

加入 1 至 10 ng pGEX6P1 USP27X 表达质粒，并在冰上孵育 5 分钟。在 42 摄氏度的干浴中对细胞进行热休克 30 秒。然后将细胞在冰上孵育 2 分钟。

向细胞中加入 80 微升室温 SOC 培养基。在 37 摄氏度下在 19 毫米轨道台式温控摇床中以 200 RPM 旋转孵育 60 分钟。然后将 50 微升培养物接种在 LB 琼脂平板上，补充氯霉素和氨苄青霉素。

在 37 摄氏度下，盖子朝下，在温控培养箱中孵育 20 小时。挑选一个转化细菌菌落，将其添加到 10 毫升补充有氯霉素和氨苄青霉素的无菌 LB 培养基中。如前所述孵育 20 小时。

然后将 10 毫升过夜培养物加入 1 升补充有氯霉素和氨苄青霉素的 TB 培养基中。孵育至 600 纳米处的光密度达到 0.5 至 0.6。接下来，向培养物中加入 50 微摩尔异丙基 β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷以诱导表达。

将样品冷却至 16 摄氏度后，在 16 摄氏度下以 200 RPM 旋转孵育 20 小时。然后在 4 摄氏度下以 3000 G 或更高的浓度离心细胞 20 分钟，以沉淀来自表达培养物的细胞。最后，将颗粒在零下 80 摄氏度下存放至少一小时。

首先，将空的重力流塔固定在蒸馏架中。用 2 至 3 mL 葡糖硫酮琼脂糖树脂填充层析柱，以纯化从 1 升表达培养物中收集的细胞沉淀。用一个树脂床体积的 20% 乙醇清洗色谱柱。

洗涤色谱柱后，在 4 摄氏度下解冻细胞沉淀。向解冻的沉淀中加入 30 毫升 MS500 缓冲液，并以温和的端到端旋转孵育。现在，在 50 mL离心管中，在冰上对裂解的细胞进行超声处理，直到裂解物从移液器吸头分配时自由流动。

在 4 摄氏度和 20， 000 G 或更高温度下离心 30 分钟，以清除上清液。然后将上清液倒入烧杯中，并将澄清的裂解物加载到柱上。在收集流出物的同时，通过重力流使裂解物通过色谱柱。

然后，用至少两个树脂床体积的 MS500 洗涤缓冲液洗涤色谱柱，并以 5 mL 馏分收集洗涤液。接下来，将每种馏分的 1 微升添加到 100 微升 Bradford 试剂中，以检查是否存在蛋白质。通过色谱柱运行 MS500 冲刺缓冲液并收集 5 mL 洗脱馏分来回收蛋白质。

要沉淀蛋白质，向洗脱液中加入两倍体积的四摩尔硫酸铵，然后轻轻倒置试管，直到它变得浑浊。在 4 摄氏度和 20， 000 G 或更高温度下离心 30 分钟。每次离心后除去上清液，不要干扰蛋白质沉淀。

然后在储存前将蛋白质重新溶解在补充有 25% 甘油的 MS500 缓冲液中。在去泛素化酶激活缓冲液中为每种去泛素化酶的每个时间点制备 10 微升纯化的 GST 标记的 USP27X。在添加泛素链之前，向零时间样品中加入 7 μL SDS-PAGE 上样缓冲液，以防止去泛素化反应开始。

对于每种去泛素化酶的每个时间点，加入 375 ng在 10 μL 酶活化缓冲液中稀释的 K63 连接二泛素链。在 30 摄氏度下孵育试管，通过添加 7 微升 SDS-PAGE 上样缓冲液停止每个时间点。使用 4% 至 12% 梯度凝胶进行 SDS-PAGE。

野生型 USP27X 在孵育 1 小时后将 K63 连接的双泛素链裂解成单泛素。XLID-105 相关方差 F313V 、 Y381H 和 S404N 在孵育 1 小时后未裂解 K63 连接的双泛素链。