植物细胞悬浮液中咖啡因的提取、酶活性及咖啡因合成酶基因的表达

该方法有助于回答分析化学、生物化学和生物技术领域的关键问题。例如，咖啡因生物合成中发生了什么变化。这项技术的主要优点是，它可以应用于产生咖啡因的植物内模型。

首先，在冻干细胞中加入10毫升丙酮，并在与涡流混合器混合30秒之前密封烧瓶。然后，在 100 rpm 时将样品与旋转器在室温下混合 5 小时。在此之后，用25微升丙酮重新悬浮样品。

首先，将先前准备的咖啡因提取物的微升剂涂抹到硅胶板中。然后，在色谱室中开发TLC，其移动相为10毫升，即环丙烷丙酮。使用紧凑型紫外线灯在短波长紫外线中可视化咖啡因波段。

在此之后，通过密度测定在273纳米量化咖啡因水平。使用滤纸，真空过滤以前准备的电池悬浮液。然后，使用瓷砂浆用液氮和RNA分离试剂对细胞样品进行检测，直到其均质化。

接下来，将样品的500微升转移到无菌微离心管中。然后，加入300微升氯仿异丙胺醇和300微升平衡酚。将样品与涡流混合器混合，在20，000G下离心，在4摄氏度下15分钟。

在此之后，将上相的300微升转移到一个干净的微型离心管中。然后，加入200微升异丙醇，在负20摄氏度下孵育管子一小时。在颗粒中加入一毫升乙醇。

然后，在12，000G下将管离心10分钟，然后将液相 dec。接下来，在室温下干燥样品1.5小时。然后，用25微升DEPC处理水重新悬浮RNA提取物。

首先，在无菌微离心管中加入两微克总RNA提取物。然后，添加一个10X反应缓冲液的微升和一个DNase微升。使用 DEPC 处理的水将最终反应量带到 10 微升。

然后，将样品混合在2000G下，并离心机一分钟。接下来，在37摄氏度下孵育样品30分钟。在此之后，加入一微升50微摩尔二甲胺二胺四乙酸酯，以停止反应。

在65摄氏度下孵育样品10分钟。然后，将100纳米的RNA涂抹在一个阿加罗斯凝胶上，然后运行凝胶。使用凝胶照片文档系统可视化 RNA 的完整性。

首先，在微型离心管中加入2.5微克总RNA。然后，加入一个微升的寡氧脱氧米丁底剂，并将管子填充到13微升的最终体积中，用无核酸酶水。混合样品，以2000G离心1分钟。

在65摄氏度下孵育样品5分钟。然后在四摄氏度的两分钟。接下来，在样品中加入4个5X反应缓冲液微升、2个dNTP混合物微升和1微升逆转录酶。

然后，轻轻混合样品，在2000G下离心一分钟。在此之后，在45摄氏度下孵育样品50分钟，然后在70摄氏度下孵育10分钟。将 7.5 微升 2X Taq DNA 聚合酶和 0.1 微摩尔 RAX 添加到 PCR 微离心管中。

然后，添加0.75微升每个前进和反向底因为:放大CCS1基因。在此之后，添加 600 纳米的 CDNA 模板。如文本协议所述，实时PCR预造放大反应。

然后，使用 PCR 软件分析数据。称出一克蜂窝材料，用铝箔包装。将样品抽取后，将其转移到玻璃瓶中，并加入2.5毫升的萃取缓冲液。

接下来，在20，000G下将样品离心20分钟，温度为4摄氏度。将 500 微升等分转化为低温小瓶。使用分光光度计，使用双辛辛酸测定，以牛血清白蛋白为标准，测量样品在562纳米的蛋白质浓度。

首先，根据文本协议，在微型离心管中准备反应混合物。然后，将总体积增加至200微升，带100毫摩尔三升HCL。请记住，在制备与放射性物质进行反应混合物时，为了自己的安全，必须遵循适当的预防措施。

将微型离心管放在冰上，加入一个可溶性分数的体积，含有7至9毫克蛋白质。然后，在30摄氏度下旋转混合物，孵育30分钟。之后，将样品在11，000G下离心5分钟。

然后，小心地回收900微升的体积，将样品转移到闪烁的小瓶中。接下来，蒸发氯仿，在室温下完全干燥。在小瓶中加入五毫升的闪烁液。

最后，使用闪烁计数器分析咖啡因中的放射性。在该协议中，通过TLC密度测定法，通过可见光谱，在273纳米的最大吸收量下，对咖啡因的吸收模式进行了分析。TLC板上咖啡因的分离曲线显示RF介于0.34和0.39之间。

从悬浮细胞中提取的RNA表现出28、18和5s RRNA亚基的清晰分离，表明样品质量高。最后，从QPCR分析中获得熔融曲线，显示咖啡因合成酶基因的单一扩增产品。该技术开发后，为生物技术和生物化学领域的研究人员探索咖啡、茶和可可的二次代谢组织培养铺平了道路。

不要忘记，使用放射性和分子病理学可能是极其危险的，在执行本程序时，应始终采取预防措施，如使用手套、护目镜和放射性物质专用设备。