基于流式细胞术的胰腺癌小鼠模型中肿瘤浸润淋巴细胞的分离和治疗评估

我们专注于开发一种在胰腺癌模型中分离和过继转移肿瘤浸润淋巴细胞 TIL 的方法。我们试图回答 TILs 的子集是否可以在体内有效靶向和杀死胰腺肿瘤，以及如何优化 T 细胞以用于未来的临床试验。过继细胞疗法的最新发展，包括增强 TIL 分离和表达技术、温和修饰 TIL 以提高其靶向性，以及将 TIL 疗法与其他免疫疗法（如检查点抑制剂或靶向疗法）相结合以增强抗肿瘤疗效。

我们已经建立了一种从胰腺癌小鼠模型中分离和扩增肿瘤反应性 TILs 的稳健方法。我们证明了过继转移的肿瘤反应性 T 细胞的抗肿瘤功效增强。与其他特异性较低的方法相比，我们的方案通过能够分离和选择肿瘤特异性 TIL 提供了一种更具针对性的过继细胞治疗方法。

它还使用生物发光成像进行无创肿瘤监测。我们的研究结果将通过提供标准化的临床前模型来评估 TIL 治疗效果和优化胰腺癌 T 细胞亚群的治疗参数，从而推动该领域的发展。为了制备用于诱导小鼠原位胰腺肿瘤的 KPC-荧光素酶细胞悬液，请在 37 摄氏度下将 KPC-荧光素酶细胞系胰蛋白酶消化 1 分钟。

胰蛋白酶消化后，加入 PBS，转移细胞，然后离心细胞悬液。计数细胞，并以 1 倍 10 的浓度重悬于含有 30% 基底膜基质的 PBS 中，达到每毫升 6 个细胞的幂次方。将麻醉的鼠标放在作平台上。

在左腹切开 0.5 至 1 厘米后，用镊子固定脾脏并露出胰腺。制备 KPC-荧光素酶细胞和基底膜基质混合物后，使用 50 号针头将含有 50， 000 个细胞的细胞悬液注入胰腺。将胰腺送回腹腔。

依次缝合腹膜和皮肤。让鼠标在温暖的垫子上恢复，直到完全唤醒。7 天后，腹膜内注射小鼠 60 微升 D-荧光素钾盐溶液进行实时成像。

麻醉后，将鼠标置于体内成像系统中进行生物发光检测。成像后，从系统中取出鼠标，让它从麻醉中自然恢复。首先，将供体安乐死的小鼠放在作平台上。

用 75% 乙醇对全身消毒。在无菌罩中，使用剪刀和镊子打开腹腔。取出肿瘤并将其置于冰上的 PBS 中。

用游标口径测量肿瘤大小。然后，使用屏幕上的公式计算肿瘤体积。在 RPMI 1640 中使用胶原酶、分散酶 II 和 DNAse I 制备 1X 消化溶液后，在 12 孔板中每孔添加 1 至 2 mL 溶液。

用剪刀将肿瘤切成小块。将肿瘤块转移到 12 孔板的每个孔中，在 37 摄氏度下消化，同时以 70 RPM 振荡 30 分钟。要终止消化，请添加 1 至 2 毫升 10% 胎牛血清，并将细胞悬液转移到收集管中。

用 PBS 洗涤 12 孔板的孔两次，以收集任何剩余的细胞。通过 70 微米细胞过滤器过滤细胞悬液，切碎并压碎组织碎片，以使用注射器柱塞的平端释放单个细胞。将滤液在 4 摄氏度下以 400 G 离心 5 分钟，然后将沉淀重悬于 5% 牛血清白蛋白中，用于流式细胞术染色。

首先，将从荷瘤小鼠中分离的细胞与来自非荷瘤小鼠的脾脏或外周血单核细胞一起放在工作平台上。用 FC 阻滞剂对细胞进行染色，并以 1 至 100 的稀释度流式抗体。将试管在冰上避光孵育 30 分钟。

孵育后，通过离心在 PBS 中洗涤细胞两次，然后将它们重悬于 PBS 中的 1% 牛血清白蛋白中。在流式细胞仪上，要对 CD45+CD3+细胞进行分选，根据 FSC-A 和 SSC-A 对活细胞进行门控，以创建门 P1。然后，基于 FSC-A 和 FSC-H 的 P1 门控单细胞以创建门 P2。使用 CD45 和 CD3 门控从 P2 中分选 CD45+CD3+细胞。将分选的细胞收集到收集管中。

在 4 摄氏度下以 400 G 离心分选的 CD45+CD3+细胞 5 分钟。将细胞重悬于小鼠血清中，浓度为 1 倍 10 至每毫升 6 个细胞的幂，并将它们置于冰上。将肿瘤诱导的受体小鼠放在作平台上。

使用 29 号 1/2 英寸胰岛素注射器，腹膜内注射分选的免疫细胞。然后，连续 3 天腹膜内注射白细胞介素 2。