我们的研究范围主要集中在开发具有更高抗肿瘤活性和体内持久性的人 iPSC CAR NK 细胞，以更好地治疗多种恶性肿瘤。通过这种新颖的 CAR iPSC NK 生成方案，我们的目标是回答这些细胞如何克服肿瘤微环境耐药性并提高疗效，并确保安全和可扩展的生产。开发 iPSC 衍生的 CAR NK 细胞的主要实验挑战包括在确保 CAR 表达稳定且无任何不良反应的情况下实现 iPSC 一致和有效的分化为功能细胞，并提高体内持久性。
此外，研究人员还面临着可扩展性、免疫排斥和临床应用监管持有者方面的挑战。通过使用基于转座子的基因修饰建立高效的基于非病毒的 CAR 基因整合，我们显着推进了 iPSC 衍生的 CAR NK 细胞研究。此外，我们还在 iPSC 水平优化了 CRISPR-Cas9 以删除免疫检查点，以改善 TMA 因子，并在实体瘤模型中改善细胞和肿瘤疗效以及体内持久性。
通过我们的方案使用非病毒背负载体介导的 CAR 基因表达，我们旨在解决 iPSC CAR NK 细胞安全、高效和可扩展的基因修饰开发的差距，这种方法降低了插入诱变的风险，增强了产生 CAR NK 细胞的可重复性和成本效益用于癌症免疫治疗。未来，我们的实验室将专注于开发针对免疫检查点的新型工程 iPSC 衍生的 NK 细胞。我们还将通过使用双特异性或三特异性抗体来研究针对各种肿瘤微环境因素，以增强体内持久性和抗肿瘤活性的特异性。
为了开始自旋胚胎体或 EB 形成传代，每孔大约 200， 000 个工程化 CAR iPSC 在含有 MT 剩余物的六孔基底膜基质预编码板中，在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育细胞，两天后，去除培养基并与 1 毫升预热的 TrypLE Select 在 37 摄氏度下孵育 5 分钟来分离细胞。然后小心地将细胞聚集体解离成单细胞悬液，并将悬液转移到 15 mL 锥形管中。加入 3 毫升 PBS 以终止解离反应。
接下来，将细胞重悬于 MK SR-plus 培养基中，并通过 70 微米细胞过滤器过滤以去除聚集体。离心细胞。用 5 毫升 PBS 洗涤沉淀，然后将它们重新悬浮在 1 毫升 EB 形成培养基中。
计数后，使用含有细胞因子和 10 微摩尔 ROCK 抑制剂的 EB 形成培养基将细胞稀释至适当的密度。使用多通道移液器在 96 孔板中的 100 微升 EB 培养基中每孔接种 3000 至 10， 000 个细胞。将细胞以 300 G 离心 5 分钟，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 6 天。
为了检查胚胎体质量，首先准备 4 毫升预热的 0.25% 胰蛋白酶和 0.4% 鸡血清以解离 EB。6 天后，将 10 至 30 个 EB 转移到 15 mL 锥形管中。将胰蛋白酶鸡血清溶液添加到 EB 中，并在水浴中孵育。
在解离期间每 3 到 5 分钟涡旋一次 EB，持续 10 分钟。移液管胰蛋白酶化的 EB 上下混合数次，以确保彻底解离。然后加入 5 毫升 PBS 以停止胰蛋白酶消化过程。
通过 70 微米的细胞过滤器将细胞溶液过滤到新的锥形管中。接下来，将细胞以 300 G 离心 5 分钟，然后将沉淀重悬于 3 至 5 mL 新鲜 EB 培养基中。计数后，用典型的 EB 标志物对细胞进行染色。
在 100 μL 流式缓冲液中，向每支含有解离的 EB 单细胞的试管中加入推荐体积的抗体，并在冰上孵育 30 分钟。孵育后，用流式缓冲液洗涤细胞两次。添加 SYTOX blue 活死细胞染色剂，并使用流式细胞术分析进行分析。
首先用 5 至 10 微升 2% 灭菌明胶溶液对六孔板的每个孔进行编码。将板在 37 摄氏度下孵育 2 到 4 小时。孵育后，吸出任何剩余的明胶溶液，并向明胶包被的六孔板的每个孔中加入 3 毫升含有细胞因子的自然杀伤剂或 NK 分化培养基。
接下来使用 1 毫升移液器，小心地将来自工程化 CAR iPSC 的离心 EB 转移到 10 厘米的培养皿中。向 6 孔板的每个孔中加入 3 毫升含有细胞因子的 NK 分化培养基。使用 1 毫升微量移液器将 16 至 20 个 EB 分配到 6 孔板的每个孔中，并在 37 摄氏度与 5% 二氧化碳下孵育 3 至 4 周。
孵育后，通过流式细胞术在悬浮细胞上评估 NK 细胞标志物 CD45 阳性和 CD56 阳性的表达。当超过 80% 的悬浮细胞表达 CD45 阳性和 CD56 阳性时。通过将细胞通过 70 微米过滤器以去除团块来收获细胞。
在共培养人工抗原呈递细胞或 NK 细胞内的人工 APC 之前，用 100 个灰度照射人工 APC 并将其保存为冷冻茎。收获 NK 细胞后，在补充有 50 单位/毫升白细胞介素-2 和白细胞介素-15 的 NK 扩增培养基中，以 5 乘以 10 倍/毫升 5 个细胞的密度培养它们。以 1:1 的比例将解冻的人工 APC 添加到 NK 细胞中，并在 37 摄氏度下与 5% 二氧化碳一起孵育。
首先，打开流式细胞仪。评估 NK 激活受体在抗 GPC3 CAR iPSC 衍生的 NK 细胞上的表达，以确定 CAR Case 细胞活性和成熟状态。用于 Caspase-3/7 检测。
对 GPC3 CAR iPSC 来源的 NK 细胞中的靶细胞进行计数，并在光照保护下，在 37 摄氏度下用终浓度为 5 微摩尔的 PBS 中的 CellTrace Violet 染料对其进行预染 15 分钟。在完全培养基中洗涤染色靶细胞，然后在 37 摄氏度下以各种效应子与靶标比例与 CAR iPSC 衍生的 NK 细胞共培养。经过 3 小时 30 分钟的共培养。
加入 Caspase-3/7 绿色检测试剂，再孵育 30 分钟。在染色的最后 5 分钟内加入 SYTOX 死细胞染色溶液，并轻轻混匀。使用流式细胞术分析染色的细胞。
在第 6 天观察到 GPC3 CAR 工程 IPC 的自旋 EB 的形成。确认早期分化。来自 GPC3 CAR IPC 的分化自然杀伤或 NK 细胞在第 3 天至第 28 天的不同阶段表现出不同的形态。
流式细胞术分析显示，在第 6 天，造血抗原 CD34 和 CD31 以及少量 CD43 的表达，但在野生型和 GPC3 CAR iPSC 衍生的自旋 EB 中尚未表达 CD45。第 35 天在 GPC3 CAR iPSC 衍生的 NK 细胞的成熟野生型中检测到病例特异性标志物。确认成功分化为 NK 细胞。
扩增的野生型和抗 GPC3 CAR iPSC 衍生的 NK 细胞表现出各种活化标志物，表明 NK 细胞成熟。使用流式细胞术在肿瘤细胞系上确认 GPC3 抗原表达，验证了抗 GPC3 CAR iPSC 衍生的 NK 细胞的靶标特异性。与野生型 iPSC NK 细胞相比，抗 GPC3 CAR iPSC 衍生的 NK 细胞对表达 GPC3 的 HepG2、SNU-449、CAL 27 和 SKOV3 细胞系表现出更高的细胞毒活性。
