生产人类CRISPR工程的CAR-T细胞

我们的实验室协议使人类基因组编辑与CAR T细胞治疗相结合。实验室程序是与CRISPR-Cas9合作的方法，针对多达三个高效基因。最后，我们的方法能够转化为人体临床试验。

所述方法可应用于其他 CAR 构造和目标基因。这些技术的基础足够牢固，可以转化为更大的规模，并转化为学术和工业合作者，以便进一步发展。首次尝试此协议时，请限制指南 RNA 屏幕上的组数，以便实现准确的孵化时间。

坚持上述培养条件和播种密度已被证明是我们的经验的关键。首先，从健康的志愿者献血者那里获得自体外周血单核细胞（PBMCs），并使用市售的CD4和CD8选择套件分离CD4和CD8阳性T细胞。将CD4正细胞和CD8阳性T细胞以一比一的比例结合，在R10中每毫升孵育300万个细胞，在37摄氏度下每毫升每毫升补充5毫微克。

第二天，用300倍G计算T细胞和离心机5000万到1000万个细胞，5分钟。丢弃所有超高非纳特，用减少的血清最小必需介质清洗细胞颗粒。根据制造商的说明，将颗粒重新悬挂在 100 微升核感性溶液中。

在清洗细胞时，通过在室温下用 5 微克单导 RNA 孵育 10 微克 Cas9 核糖，准备核糖核蛋白或 RNP 复合物，为期 10 分钟。包括一个没有单一导引RNA的模拟控制。将重新悬浮的细胞与RNP复合物相结合，加入4个微摩尔电聚变增强剂的4.2微升。

混合好，并转移到电聚库韦茨。使用脉冲代码EH111对细胞进行电聚，然后以R10每毫升孵育500万个细胞，在12个井板中每毫升人体IL7和人IL15在30摄氏度下再孵育5纳米克，48小时。孵化后，继续进行T细胞激活和扩展。

通过将 PCR 放大器序列输入标准引点设计软件来设计测序引引器。设计软件将建议多个适合桑格测序的入门序列。选择与放大器结合的前进和反向底漆，在 gRNA 切割站点的上游或下游至少 150 个碱基对，以确保在 indels 周围良好的测序质量。

使用 TIDE 分析在基因组水平上检测淘汰效率。该算法从序列轨迹中精确重建了 Indels 的光谱，并计算了 R 方值。激活后，T细胞在培养中扩大，并为未来的研究保存低温。

在扩展期间，在整个协议中跟踪模拟和编辑的 CAR T 单元格的人口翻倍和体积变化。在扩展过程中，未检测到增殖和激活的重大变化。一旦细胞被冷冻保存，CAR表达水平被确定为进一步的功能研究的模拟编辑和淘汰CAR T细胞。

未观察到重大变化。敲击效率可以使用多种技术确定。在这些具有代表性的流细胞学图中，PDCD1 和 TRAC loci 使用单导 RNA 作为目标，显示 PDCD1 单导 RNA 的效率为 90%，在多个健康捐赠者中用于 TRAC 单导 RNA 的效率为 98%。

重要的是要确保Cas9和指南RNA的摩尔比率是准确的。在手术过程中，细胞应始终保持在摄氏四度，而不是长时间留在电聚液中。在CAR保存后，CRISPR设计的CAR T细胞可用于体外和体内功能检测，如细胞毒性检测、细胞因子生产以及合成或异位肿瘤小鼠模型。

我们使用CRISPR Cas9技术的方法现在正应用于临床试验。这种方法既可用于癌症，也可用于非恶性遗传性疾病，如血红蛋白，影响全世界数百万儿童和成人。