O escopo de nossa pesquisa se concentra principalmente no desenvolvimento de células iPSC CAR NK humanas com atividade antitumoral aprimorada e persistência in vivo para melhor tratar diversos malignos. Com este novo protocolo de geração CAR iPSC NK, pretendemos responder como essas células podem superar a resistência microambiental do tumor e melhorar a eficácia e garantir uma produção segura e escalável. Os principais desafios experimentais no desenvolvimento de células CAR NK derivadas de iPSC incluem alcançar uma diferenciação consistente e eficiente de iPSC em funcional nos casos que garantem a expressão estável de CAR sem quaisquer efeitos adversos e melhoram a persistência in vivo.
Além disso, os pesquisadores enfrentam desafios em escalabilidade, rejeições imunológicas e detentores regulatórios para aplicações clínicas. Avançamos significativamente na pesquisa de células CAR NK derivadas de iPSC, estabelecendo uma integração eficiente do gene CAR não viral usando modificações genéticas baseadas em transposons. Além disso, otimizamos o CRISPR-Cas9 no nível do iPSC para excluir pontos de verificação imunológicos, fatores de TMA para melhorar e casos de células e eficácia do tumor e persistência in vivo em modelos de tumores sólidos.
Com nosso protocolo usando a expressão gênica CAR mediada por vetor piggyback não viral, pretendemos abordar a lacuna para o desenvolvimento de modificação gênica segura, eficiente e escalável para células CAR NK iPSC, este método reduz o risco de mutagênese insercional aumenta a reprodutibilidade e a relação custo-benefício da geração de células CAR NK para imunoterapia contra o câncer. No futuro, nosso laboratório se concentrará no desenvolvimento de novas células NK derivadas de iPSC direcionadas a pontos de verificação imunológicos. Também investigaremos o direcionamento de vários fatores microambientais tumorais usando anticorpos biespecíficos ou triespecíficos para aumentar a especificidade in vivo, a persistência e a atividade antitumoral.
Para iniciar a passagem do corpo embrionário giratório ou da formação de EB, aproximadamente 200.000 CAR iPSCs projetados por poço em uma placa pré-codificada de matriz de membrana basal de seis poços contendo excedente de MT, incubar as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono, após dois dias, remover o meio de cultura e separar as células incubando com um mililitro de TrypLE Select pré-aquecido a 37 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, dissociar cuidadosamente os agregados celulares numa única suspensão celular e transferir a suspensão para um tubo cónico de 15 mililitros. Adicione três mililitros de PBS para interromper a reação de dissociação.
Em seguida, ressuspenda as células em meio MK SR-plus e filtre-as através de um filtro de células de 70 micrômetros para remover os agregados. Centrifugue as células. Lave o pellet com cinco mililitros de PBS e depois ressuspenda-os em um mililitro de meio de formação EB.
Após a contagem, diluir as células até a densidade apropriada usando um meio de formação de EB contendo citocinas e inibidor de ROCK 10 micromolar. Usando uma pipeta multicanal, semeie de 3000 a 10.000 células por poço em 100 microlitros de meio EB em uma placa de 96 poços. Centrifugue as células a 300 G por cinco minutos e incube a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por seis dias.
Para verificar a qualidade do corpo do embrião, primeiro prepare quatro mililitros de 0,25% de tripsina pré-aquecido com 0,4% de soro de frango para dissociar os EBs. após seis dias, transferir 10 a 30 EBs para um tubo cônico de 15 mililitros. Adicione a solução de soro de frango com tripsina aos EBs e incube-os em banho-maria.
Vórtice dos EBs durante a dissociação a cada três a cinco minutos por 10 minutos. Pipete os EBs tripsinizados misturando para cima e para baixo várias vezes para garantir uma dissociação completa. Em seguida, adicione cinco mililitros de PBS para interromper o processo de tripsinização.
Filtrar a solução celular através de um filtro de células de 70 micrómetros para um novo tubo cónico. Em seguida, centrifugue as células a 300 G por cinco minutos e ressuspenda o pellet em três a cinco mililitros de meio EB fresco. Após a contagem, core as células com marcadores EB típicos.
Adicione o volume recomendado de anticorpos a cada tubo contendo células individuais dissociadas de EB em 100 microlitros de tampão de fluxo e incube em gelo por 30 minutos. Após a incubação, lave as células duas vezes com tampão de fluxo. Adicione a coloração de mortos-vivos azul SYTOX e analise usando a análise de citometria de fluxo.
Comece codificando cada poço de uma placa de seis poços com cinco a 10 microlitros de uma solução de gelatina esterilizada a 2%. Incube a placa a 37 graus Celsius por duas a quatro horas. Após a incubação, aspire qualquer solução de gelatina restante e adicione três mililitros do natural killer ou meio de diferenciação NK contendo citocinas a cada poço da placa de seis poços revestida com gelatina.
Em seguida, usando uma pipeta de um mililitro, transfira cuidadosamente os EBs de spin derivados de CAR iPSCs projetados para um prato de 10 centímetros. Adicione três mililitros de meio de diferenciação NK contendo citocinas a cada poço da placa de seis poços. Usando uma micropipeta de um mililitro, distribui de 16 a 20 EBs em cada poço da placa de seis poços e incuba a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por três a quatro semanas.
Após a incubação, avaliar a expressão dos marcadores de células NK CD45 positivo e CD56 positivo por citometria de fluxo em células em suspensão. Quando mais de 80% das células em suspensão expressam CD45 positivo e CD56 positivo. Colha as células passando-as por um filtro de 70 micrômetros para remover aglomerados.
Antes de co-cultivar células apresentadoras de antígenos artificiais ou APCs artificiais dentro das células NK, irradie as APCs artificiais com 100 cinzas e preserve-as como caules congelados. Após a colheita das células NK, cultive-as a uma densidade de cinco vezes 10 elevado à potência de cinco células por mililitro em meio de expansão NK suplementado com 50 unidades por mililitro de Interleucina-2 e Interleucina-15. Adicione APCs artificiais irradiados de descongelamento às células NK na proporção de um para um e incube a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.
Para começar, ligue o citômetro de fluxo. Avalie a expressão do receptor de ativação NK nas células NK derivadas de CAR iPSC anti GPC3 para determinar a atividade da célula car case e o status de maturação. Para os ensaios de Caspase-3/7.
Conte as células-alvo em células NK derivadas de GPC3 CAR iPSC e pré-core-as com corante CellTrace Violet em uma concentração final de cinco micromolares em PBS sob proteção contra luz por 15 minutos a 37 graus Celsius. Lave as células-alvo da coloração em um meio de cultura completo Antes da co-cultura com células NK derivadas de CAR iPSC em várias proporções efetor para alvo a 37 graus Celsius. Após três horas e 30 minutos de co-cultura.
Adicione o reagente de detecção verde Caspase-3/7 e incube por mais 30 minutos. Adicione a solução de coloração de células mortas SYTOX durante os últimos cinco minutos de coloração e misture suavemente. Analise as células coradas usando citometria de fluxo.
A formação de EBs de spin a partir de IPCs projetados por GPC3 CAR foi observada no sexto dia. Confirmando a diferenciação precoce. Células natural killer ou NK diferenciadas de GPC3 CAR IPCs mostraram morfologia distinta em vários estágios do dia três ao dia 28.
A análise por citometria de fluxo demonstra a expressão dos antígenos hematopoiéticos CD34 e CD31, bem como uma pequena quantidade de CD43, mas ainda não expressando CD45 em iPSCs de spin derivados de CAR do tipo selvagem e GPC3 no sexto dia. Em casos específicos, marcadores foram detectados no tipo selvagem maduro em células NK derivadas de GPC3 CAR iPSC no dia 35. Confirmando a diferenciação bem-sucedida em células NK.
As células NK derivadas de iPSC do tipo selvagem expandido e anti-GPC3 CAR exibiram vários marcadores de ativação, demonstrando maturação das células NK. A expressão do antígeno GPC3 foi confirmada em linhagens de células tumorais usando citometria de fluxo, validando a especificidade do alvo para células NK derivadas de CAR iPSC anti GPC3. As células NK derivadas de CAR iPSC anti GPC3 demonstraram maior atividade citotóxica contra as linhagens celulares HepG2, SNU-449, CAL 27 e SKOV3 que expressam GPC3 em comparação com as células NK iPSC do tipo selvagem.
