Araştırmamızın kapsamı temel olarak, çeşitli malignleri daha iyi tedavi etmek için gelişmiş anti-tümör aktivitesi ve in-vivo kalıcılığa sahip insan iPSC CAR NK hücrelerinin geliştirilmesine odaklanmaktadır. Bu yeni CAR iPSC NK üretim protokolü ile, bu hücrelerin tümör mikro çevresel direncinin üstesinden nasıl gelebileceğini, etkinliği nasıl artırabileceğini ve güvenli ve ölçeklenebilir üretimi nasıl sağlayabileceğini yanıtlamayı amaçlıyoruz. iPSC'den türetilmiş CAR NK hücrelerinin geliştirilmesindeki ana deneysel zorluklar, iPSC'nin tutarlı ve verimli bir şekilde fonksiyonel hale getirilmesini, herhangi bir yan etki olmaksızın stabil CAR ekspresyonunun sağlanmasını ve in-vivo kalıcılığın iyileştirilmesini içerir.
Ek olarak, araştırmacılar ölçeklenebilirlik, bağışıklık reddi ve klinik uygulamalar için düzenleyici tutucular konusunda zorluklarla karşı karşıyadır. Transpozon tabanlı gen modifikasyonları kullanarak verimli viral olmayan tabanlı CAR gen entegrasyonu kurarak iPSC'den türetilen CAR NK hücre araştırmasını önemli ölçüde ilerlettik. Ek olarak, CRISPR-Cas9'u immün kontrol noktalarını, TMA faktörlerini iyileştirmek için iPSC seviyesinde optimize ettik ve katı tümör modellerinde hücreleri ve tümör etkinliğini ve in-vivo kalıcılığı vakalara dönüştürdük.
Viral olmayan piggyback vektör aracılı CAR gen ekspresyonu kullanan protokolümüzle, iPSC CAR NK hücreleri için güvenli, verimli ve ölçeklenebilir gen modifikasyonunun geliştirilmesi için boşluğu ele almayı amaçlıyoruz, bu yöntem insersiyonel mutajenez riskini azaltır kanser immünoterapisi için CAR NK hücreleri üretmenin tekrarlanabilirliğini ve maliyet etkinliğini artırır. Gelecekte laboratuvarımız, immün kontrol noktalarını hedef alan yeni tasarlanmış iPSC türevi NK hücrelerinin geliştirilmesine odaklanacaktır. Ayrıca, in vivo kalıcılık ve anti-tümör aktivitesini arttırmak için bispesifik veya trispesifik antikorlar kullanarak çeşitli tümör mikro çevresel faktörlerini hedeflemeyi araştıracağız.
Spin embriyo gövdesi veya EB oluşum geçişine başlamak için, MT fazlası içeren altı kuyulu bazal membran matrisi önceden kodlanmış bir plakada kuyu başına yaklaşık 200.000 mühendislik ürünü CAR iPSC, hücreleri 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile inkübe edin, iki gün sonra, kültür ortamını çıkarın ve beş dakika boyunca 37 santigrat derecede bir mililitre ön ısıtma TrypLE Select ile inkübe ederek hücreleri ayırın. Daha sonra hücre agregalarını dikkatlice tek hücreli bir süspansiyona ayırın ve süspansiyonu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Ayrışma reaksiyonunu durdurmak için üç mililitre PBS ekleyin.
Daha sonra, hücreleri MK SR-plus ortamında yeniden askıya alın ve agregaları çıkarmak için 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden süzün. Hücreleri santrifüjleyin. Peletleri beş mililitre PBS ile yıkayın ve ardından bir mililitre EB oluşum ortamında tekrar süspanse edin.
Saydıktan sonra, sitokinler ve 10 mikromolar ROCK inhibitörü içeren bir EB oluşum ortamı kullanarak hücreleri uygun yoğunluğa seyreltin. Çok kanallı bir pipet kullanarak, 96 oyuklu bir plakada 100 mikrolitre EB ortamında oyuk başına 3000 ila 10.000 hücre tohumlayın. Hücreleri 300 G'de beş dakika santrifüjleyin ve altı gün boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin.
Embriyo vücut kalitesini kontrol etmek için önce EB'leri ayırmak için dört mililitre önceden ısıtılmış %0.25 tripsin ve %0.4 tavuk serumu hazırlayın. altı gün sonra 10 ila 30 EB'yi 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. EB'lere tripsin tavuk serumu çözeltisi ekleyin ve bir su banyosunda inkübe edin.
Ayrışma sırasında EB'leri 10 dakika boyunca her üç ila beş dakikada bir girdaplamak. Tam ayrışmayı sağlamak için tripsinizlenmiş EB'leri birkaç kez yukarı ve aşağı karıştırarak pipetleyin. Ardından, tripsinizasyon işlemini durdurmak için beş mililitre PBS ekleyin.
Hücre çözeltisini 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden yeni bir konik tüpe süzün. Daha sonra, hücreleri 300 G'de beş dakika santrifüjleyin ve peleti üç ila beş mililitre taze EB ortamında yeniden süspanse edin. Saydıktan sonra, hücreleri tipik EB işaretleyicileri ile boyayın.
100 mikrolitre akış tamponunda ayrışmış tek EB hücreleri içeren her tüpe önerilen antikor hacmini ekleyin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hücreleri akış tamponu ile iki kez yıkayın. SYTOX mavi canlı ölü boyası ekleyin ve akış sitometrisi analizini kullanarak analiz edin.
Altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğunu% 2'lik sterilize edilmiş jelatin çözeltisinden beş ila 10 mikrolitre ile kodlayarak başlayın. Plakayı 37 santigrat derecede iki ila dört saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, kalan jelatin çözeltisini aspire edin ve jelatin kaplı altı oyuklu plakanın her bir oyuğuna sitokin içeren üç mililitre doğal öldürücü veya NK farklılaşma ortamı ekleyin.
Daha sonra, bir mililitrelik bir pipet kullanarak, tasarlanmış CAR iPSC'lerden türetilen spin EB'leri dikkatlice 10 santimetrelik bir tabağa aktarın. Altı oyuklu plakanın her bir oyuğuna sitokin içeren üç mililitre NK farklılaşma ortamı ekleyin. Bir mililitrelik bir mikro pipet kullanarak, altı kuyucuklu plakanın her bir oyuğuna 16 ila 20 EB dağıtır ve üç ila dört hafta boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe eder.
İnkübasyondan sonra, süspansiyon hücreleri üzerindeki akış sitometrisi ile NK hücre belirteçleri CD45 pozitif ve CD56 pozitif ekspresyonunu değerlendirin. Süspansiyon hücrelerinin% 80'inden fazlası CD45 pozitif ve CD56 pozitif eksprese ettiğinde. Kümeleri çıkarmak için hücreleri 70 mikrometrelik bir filtreden geçirerek hasat edin.
Yapay antijen sunan hücreleri veya yapay APC'leri NK hücreleri içinde birlikte kültürlemeden önce, yapay APC'leri 100 gri ile ışınlayın ve donmuş saplar olarak koruyun. NK hücrelerini hasat ettikten sonra, mililitre başına 50 birim Interlökin-2 ve Interlökin-15 ile desteklenmiş NK genleşme ortamında mililitre başına beş hücrenin gücüne 10 kat daha fazla bir yoğunlukta kültürleyin. Çözülerek ışınlanmış yapay APC'leri NK hücrelerine bire bir oranında ekleyin ve 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile inkübe edin.
Başlamak için akış sitometresini açın. Araba kasası hücre aktivitesini ve olgunlaşma durumunu belirlemek için NK aktivasyon reseptörünün anti GPC3 CAR iPSC'den türetilmiş NK hücreleri üzerindeki ekspresyonunu değerlendirin. Kaspaz-3/7 tahlilleri için.
GPC3 CAR iPSC'den türetilmiş NK hücrelerindeki hedef hücreleri sayın ve bunları 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca ışık koruması altında PBS'de beş mikromolar final konsantrasyonunda CellTrace Violet boya ile önceden boyayın. Leke hedef hücrelerini tam bir kültür ortamında yıkayın 37 santigrat derecede çeşitli efektör-hedef oranlarında CAR iPSC'den türetilmiş NK hücreleri ile ko-kültürden önce. Üç saat 30 dakikalık ortak kültürden sonra.
Caspase-3/7 yeşil tespit reaktifi ekleyin ve 30 dakika daha inkübe edin. Boyamanın son beş dakikasında SYTOX ölü hücre boyama solüsyonu ekleyin ve hafifçe karıştırın. Akış sitometrisi kullanarak lekeli hücreleri analiz edin.
GPC3 CAR tarafından tasarlanmış IPC'lerden spin EB'lerin oluşumu altıncı günde gözlemlendi. Erken farklılaşmanın doğrulanması. GPC3 CAR IPC'lerinden farklılaşmış doğal öldürücü veya NK hücreleri, üçüncü günden 28. güne kadar çeşitli aşamalarda farklı morfoloji gösterdi.
Akış sitometrik analizi, hematopoietik antijenler CD34 ve CD31'in yanı sıra az miktarda CD43'ün ekspresyonunu gösterir, ancak altıncı günde hem vahşi tip hem de GPC3 CAR iPSC'lerinden türetilen spin EB'lerde henüz CD45 eksprese etmez. Vakaya özgü belirteçler, 35. günde GPC3 CAR iPSC türevi NK hücrelerinde olgun vahşi tipte tespit edildi. NK hücrelerine başarılı farklılaşmanın doğrulanması.
Genişletilmiş vahşi tip ve anti GPC3 CAR iPSC'den türetilen NK hücreleri, NK hücre olgunlaşmasını gösteren çeşitli aktivasyon belirteçleri sergiledi. GPC3 antijen ekspresyonu, akış sitometrisi kullanılarak tümör hücre hatlarında doğrulandı ve anti GPC3 CAR iPSC'den türetilmiş NK hücreleri için hedef özgüllüğü doğruladı. Anti GPC3 CAR iPSC türevi NK hücreleri, vahşi tip iPSC NK hücrelerine kıyasla HepG2, SNU-449, CAL 27 ve SKOV3 hücre hatlarını eksprese eden GPC3'e karşı daha yüksek sitotoksik aktivite göstermiştir.
