Cystic Fibrosis Aggregate Biofilm Model to Study Infection-relevant Gene Expression

我们的研究在人工痰中开发了一种聚集生物膜模型，以复制囊性纤维化患者的肺部感染。该模型使我们能够分析基因表达变化，并了解为什么与标准药物测试环境相比，细菌在这些情况下对治疗更具耐药性。开发复杂的生物膜模型凸显了概括恶劣肺部环境的挑战，这使得预测体外抗菌作用是否与体内结果一致具有挑战性。

CF 肺部感染的患者特异性使开发用于测试抗菌药物的有效实验室模型进一步复杂化。在整个研究过程中，我们成功地创建了一个多微生物聚集体生物膜模型，该模型提供了一个在真实环境中测试抗菌剂的平台，显示了在这些生物膜中可以观察到的耐药性水平，并强调了针对藻酸盐等成分的抗毒力疗法的潜力。拥有旨在模拟 CF 肺部环境的抗菌测试模型将弥合体内和体外测试之间存在的差距。

此外，在更接近 CF 肺的环境中评估细菌的病毒组将有助于开发和测试抗毒力疗法。首先，将来自冷冻珠原液培养物的铜绿假单胞菌 PAO1 的单个珠子划线到溶原肉汤螺旋钻上。将板在 24 摄氏度下孵育 37 小时。

对于单物种生物膜制备，用条纹板中的单个菌落制备铜绿假单胞菌 PAO1 的过夜培养物，并孵育过夜 18 小时。然后，在 600 纳米处将培养物稀释至 0.05 的光密度，相当于每毫升 8 个菌落形成单位的 1 倍 10 倍。此外，在 SCFM2 培养基中将该培养物稀释 1 至 100。

接下来，将 180 微升接种物添加到圆底 96 孔微量滴定板的孔中。将板在 37 摄氏度下孵育，同时以每分钟 75 转的速度摇动 24 小时。如前所述，从冷冻珠原液培养物中恢复铜绿假单胞菌 PAO1 和金黄色葡萄球菌 SH1000。

将白色念珠菌 CAF 2.1 作为单珠条纹复活到 sabouraud 葡萄糖琼脂上，并在 37 摄氏度下孵育板 24 小时。在 5 毫升溶原肉汤中制备金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的过夜培养物，其中具有来自各自条纹板的单个菌落。稀释标准化培养物以形成在 SCFM2 中含有所需浓度的两种物种的单一接种物。

然后，将 162 μL 混合接种物添加到 96 孔微量滴定板的孔中。将板在 37 摄氏度下孵育，同时以每分钟 75 转的速度摇动 24 小时，以形成多物种生物膜。接下来，将 14.2 微升制备的铜绿假单胞菌过夜培养物添加到 96 孔微量滴定板的孔中，并再次孵育板以形成多微生物生物膜。

首先，在 96 孔微量滴定板中获得单物种和多物种生物膜。为了破坏生物膜，将 8.81 微升 DNase 1 原液直接添加到含有生物膜的孔中，达到每毫升 50 微克的最终浓度。将板在 37 摄氏度下孵育 1 小时，同时以每分钟 75 转的速度摇动。

获得美罗培南 2.56 毫克/毫升的抗生素储备液。以 2 倍的速度进行连续稀释，以达到 0.01 毫克/毫升至 2.56 毫克/毫升的浓度范围。现在，将 20 微升每种米罗培南稀释液添加到生物膜中，达到每毫升 1 微克至 256 微克/毫升的剂量范围。

用透明薄膜密封 96 孔微量滴定板，并在 37 摄氏度下孵育 24 小时，同时每分钟摇动 75 转。当用美罗培南以高达 256 μg/mL 的任何剂量处理时，单物种假单胞菌生物膜显示活细胞没有显着减少。在单一物种环境中，铜绿假单胞菌的回收率比在没有抗生素的多微生物环境中每毫升高 0.74 log 10 菌落形成单位。

首先，准备用于 RNA 提取的单物种和多物种生物膜。孵育后，将生物膜从每个孔转移到 1 毫升微量离心管中，混合每个样品的生物膜重复。将试管以 16， 000 G 离心 5 分钟。

如果稍后进行 RNA 提取，请去除上清液，并将沉淀储存在 80 摄氏度的 250 微升 RNA 稳定溶液中。然后，在室温下用沉淀解冻试管，并以 16， 000 G 离心 5 分钟。将沉淀重悬于 600 μL TRIzol 试剂中，并使用连接到 2 mL 注射器的 0.2 mm 针头手动破碎沉淀，吸出 5 至 10 次，或直到沉淀完全破碎。

按照制造商的指南从被破坏的生物膜中纯化 RNA。为了定量纯化的 RNA，每个样品用 199 μL 缓冲液和 1 μL 试剂制备工作溶液。将 190 微升工作溶液和 10 微升标准 1 和标准 2 混合到单独的试管中。

然后，将 199 μL 的工作溶液和 1 μL RNA 样品加入单独的试管中。涡旋 30 秒，并在避光处存放 5 分钟。接下来，在荧光计上，选择 RNA，然后选择 Broad Range RNA，然后按照屏幕上的说明进行作。

读取空白读数后，将 1 微升 RNA 移液到分光光度计的样品架上，并测量 260 x 280 纳米的吸光度。对于互补的 DNA 合成，请在试管中制备反应混合物。将试管放入热循环仪中并运行程序。

立即使用 CDNA，或将其储存在 80 摄氏度。单物种铜绿假单胞菌生物膜中的 algD 表达在美罗培南浓度下没有显著变化。在多微生物生物膜中，algD 表达显着升高至 256 μg/mL，表明在共定植生物存在下藻酸盐产量增加。