表征人类肠道微生物群中 C-糖苷代谢酶的结构生物学和分析化学方法。协议。一、蛋白质生产和纯化。表达载体的构建。
从 NCBI 获取基因簇序列 GenBank LC422372.1。将基因克隆到修饰的 pET-28a 载体中。将质粒转化到大肠杆菌 BL21 DE3 感受态细胞中。
随后在 LB 培养基中用 50 μg/ml 卡那霉素在 37 度下培养细菌。当细菌密度 OD 600 达到 0.6 时，向培养基中加入 0.2 毫摩尔 IPTG。在 16 度下培养细菌 16 小时。
在 4 度下以 4， 000 倍 g 离心细菌培养物。弃去上清液并保留细菌沉淀。在缓冲液中重悬细菌沉淀 A.蛋白质纯化。
在细菌重悬液中加入 1 毫摩尔 PMSF。通过超声波细胞破碎机裂解细菌悬浮液。将细菌裂解物在 4 度下以 48， 000 倍 g 离心 40 分钟。
使用镍亲和色谱 NTA 柱纯化上清液中的蛋白质。用缓冲液 B 以梯度洗脱结合的蛋白质。从 SDS-PAGE 中收集具有高 UV 280 纳米吸收率和清晰蛋白质条带的样品，用于下一步。
用缓冲液 C 透析样品，使用离子交换色谱柱纯化透析的蛋白质。用 Buffer C 将目标蛋白结合到柱上，用 Buffer D 成分洗脱结合的蛋白。使用含有缓冲液 E 的体积排阻柱纯化蛋白质。
将蛋白质样品浓缩至每毫升 20 毫克，分装，用液氮快速冷冻。将其存放在 80 度以备将来使用。使用具有 UV 280 纳米的 QuickDrop 测量蛋白质浓度。
圆二色性、CD、光谱数据收集。在一次 PBS 缓冲液 （pH 7.4） 中将蛋白质稀释至 0.2 毫克/毫升。将仪器扫描速度设置为 50 纳米/分钟，将光谱带宽设置为 1 纳米。
收集 200 至 260 纳米波长范围内的 CD 光谱数据。减去 PBS 背景，并从三次测量中取平均值。二、蛋白质晶体学和结构化测定。
蛋白质晶体生长和优化。在 48 孔晶体板上使用蛋白质结晶试剂盒，通过静滴法进行结晶初步筛选。设置沉淀剂和蛋白质浓度梯度，以使用悬滴法优化蛋白质结晶。
完全生长后，将晶体转移到含有储液槽缓冲液和目标化合物的 16 度浸泡溶液中 30 分钟。将晶体转移至含有补充 25% 甘油的结晶缓冲液的冷冻保护剂溶液中，并立即储存在液氮中以进行数据收集。蛋白质晶体的数据收集和结构化测定。
使用 0.978 埃的入射波长在 NFPS 的 SSRF 光束线上收集完整的 X 射线衍射数据集。最初使用程序晶体学数据处理软件处理晶体衍射数据。使用自动数据处理程序执行阶段划分。
使用晶体结构测定软件进行自动结构模型优化和优化。三、反应活性监测和动力学参数的测定。通过 HPLC 监测 DgpA/B/C 活性。
将 C-糖苷切割反应系统组装在 PBS 缓冲液中，pH 值为 7.4，含有 20 微摩尔/毫升 DgpA/B/C、1 毫摩尔/升锰离子、1 毫摩尔/升 NAD、10 毫摩尔/升 DTT 和 0.1 毫摩尔/升底物、葛根素、大豆苷、染料木素。通过移液充分混合，并在 37 度下孵育 8 小时。向反应体系中加入三倍量的甲醇以终止反应。
将反应液以 16， 000 倍 g 离心 15 分钟以除去沉淀。使用 0.22 微米滤膜过滤上清液。以每分钟 1 毫升的流速、UV 265 纳米的检测波长和 10 微升的进样体积进行梯度洗脱，进行 HPLC 分析。
用 2,6-二氯苯酚吲哚酚，DCPIP 测定法监测 DgpA 活性。将 0.8 毫摩尔/升 DCPIP、50 微摩尔/升蛋白质和 10 毫摩尔/升底物在一次 PBS 缓冲液（pH 7.4）中孵育。反应 20 小时后，使用酶标仪记录 DCPIP 在 600 纳米处的吸光度变化。
测定葡萄糖对葛根素 C-糖苷键裂解反应的抑制率。如第 3.1 节所述，在一次 PBS 缓冲液 （pH 7.4） 中以不同浓度的葡萄糖与反应系统进行反应。在 37 度下进行反应 12 小时。
使用 HPLC 对生成的产品进行定量分析。动力学参数的测定。在 DgpA/B/C C-糖苷裂解反应中，葛根素的浓度设定为每升 0.01 至 4 毫摩尔，而大豆苷和染料木素的浓度为每升 0.01 至 2 毫摩尔。
根据第 3.1 节中描述的方法在 37 度下进行反应 8 小时。通过将计算的反应速率和底物浓度拟合到 Prism 中的 Michaelise-Menten 模型来推导出 Km 和 kcat 动力学参数。四、反应中间产物的制备和检测。
制备反应中间产物。使用 daidzin 和 genistin 作为底物，根据第 3.1 节中描述的方法使用 90 毫升的反应系统进行反应。使用带有制备液相色谱柱的制备型 HPLC 纯化中间产物。
用真空离心浓缩器干燥纯化的中间产物以备将来使用。使用 LC-MS 表征反应中间产物。将 daidzin 和 genistin 反应中纯化的中间产物的一部分溶解在甲醇中，以 50 μg/mL 的浓度制备每种化合物的溶液。
以 13 500 次 g 离心 10 分钟，并收集用于 LC-MS/MS 分析的酶解剂。使用与 HPLC 分析中相同的梯度洗脱程序进行 LC-MS 分析，进样体积为 5 μL。用 NMR 表征反应中间产物。
将 daidzin 反应中纯化的中间产物的一部分溶解在二甲基亚砜氘化 6 中，用于质子和碳 13 NMR 波谱。在 NMR 仪器上以 400 兆赫兹的质子记录 NMR 波谱。在 NMR 仪器上以 175 兆赫兹的速度记录碳 13 的 NMR 波谱。
代表性结果。总体而言，我们设计了一种组合实验方法，包括蛋白质生产和纯化、结晶实验、活性测定以及图 1 中反应产物结构的鉴定。具体来说，我们在图 2 中通过三步纯化层析、离子交换层析和凝胶过滤层析获得了高纯度蛋白质。
在结晶实验中，我们确定了图 3A 至 D 中 DgpA 的晶体结构和分辨率分别为 2.7 埃和 2.1 埃的 DgpB/C 复合物，我们进一步发现 DgpA 在图 3B 和 C 中以六聚体形式采用自抑制确认，这在图 3F 中使用 DCPIP 还原测定进行了验证。接下来，我们发现葡萄糖与图 3E 中 DgpA 底物识别口袋中的关键氨基酸形成氢键网络。基于此，我们设计了突变体并使用图 3J 中的动力学参数评估了它们的底物切割活性。
有趣的是，在O-糖苷类黄酮和DgpA/B/C的裂解过程中，我们观察到图4A和B中中间化合物的形成，这些中间体在图4C至H中通过NMR和LC-MS分析被鉴定为C-糖苷类黄酮，表明DgpA/B/C可以将O-糖苷转化为C-糖苷。我们率先将化学与生物技术相结合，研究 C-糖苷类代谢酶的结构和功能特性，证明这是一个合理实用的解决方案。这种方法填补了该领域内研究方法的空白，可以很容易地应用于具有不同代谢功能的其他基因。
因此，它也为未来研究其他肠道微生物功能蛋白的结构和功能特征提供了新的参考模型。
