Approches de biologie structurale et de chimie analytique pour caractériser les enzymes métaboliques C-glycosides dans le microbiote intestinal humain. Protocole. Premièrement, la production et la purification de protéines. Construction du vecteur d’expression.
Obtenez la séquence de groupe de gènes GenBank LC422372.1 auprès du NCBI. Clonez les gènes dans un vecteur pET-28a modifié. Transformer les plasmides en cellules compétentes E.coli BL21 DE3.
Par la suite, cultivez les bactéries dans un milieu LB avec 50 microgrammes par millilitre de kanamycine à 37 degrés. Ajoutez 0,2 millimoles d’IPTG au milieu lorsque la densité bactérienne OD600 atteint 0,6. Cultivez les bactéries à 16 degrés pendant 16 heures.
Centrifuger la culture bactérienne à 4 000 fois g à quatre degrés. Jetez le surnageant et conservez la pastille bactérienne. Remettre en suspension la pastille bactérienne dans le tampon A.Purification de la protéine.
Ajouter un millimole de PMSF à la remise en suspension bactérienne. Lyse la suspension bactérienne à l’aide d’un briseur de cellules à ultrasons. Centrifugez le lysat bactérien à 48 000 fois g pendant 40 minutes à quatre degrés.
Purifier la protéine dans le surnageant à l’aide de la colonne NTA de chromatographie d’affinité nickel. Éluer la protéine liée avec le tampon B dans un gradient. Prélevez des échantillons avec une absorption UV élevée de 280 nanomètres et des bandes de protéines claires de SDS-PAGE pour l’étape suivante.
Dialyser les échantillons contre le tampon C.Purifier la protéine dialysée à l’aide d’une colonne de chromatographie d’échange d’ions. Lier la protéine cible à la colonne avec le tampon C. Éluer la protéine liée avec l’ingrédient du tampon D. Purifiez la protéine à l’aide d’une colonne d’exclusion stérique avec tampon E.Prélevez des échantillons de protéines pour l’étape suivante.
Concentrez les échantillons de protéines à 20 milligrammes par millilitre, aliquotez-les, congelez-les rapidement avec de l’azote liquide. Rangez-le à 80 degrés pour une utilisation future. Mesurez la concentration en protéines à l’aide de QuickDrop avec UV 280 nanomètres.
Dichroïsme circulaire, CD, collecte de données spectrales. Diluez les protéines à 0,2 milligramme par millilitre dans un tampon PBS en une fois, pH 7,4. Réglez la vitesse de balayage de l’instrument à 50 nanomètres par minute et la bande passante spectrale à un nanomètre.
Collectez des données spectrales CD dans la gamme de longueurs d’onde de 200 à 260 nanomètres. Soustrayez l’arrière-plan PBS et prenez la valeur moyenne de trois mesures. Deuxièmement, la cristallographie des protéines et la détermination structurée.
Croissance et optimisation des cristaux de protéines. Effectuez un criblage initial de cristallisation avec la méthode sitting-drop à l’aide des kits de cristallisation des protéines sur des plaques de cristaux à 48 puits. Réglez les gradients de précipitation et de concentration en protéines pour optimiser la cristallisation des protéines à l’aide de la méthode de la goutte suspendue.
Transférez les cristaux dans une solution de trempage contenant un tampon de réservoir et des composés cibles à 16 degrés pendant 30 minutes après la croissance complète. Transférez les cristaux dans une solution cryoprotectrice contenant un tampon de cristallisation complété à 25 % de glycérol et immédiatement stocké dans de l’azote liquide pour la collecte de données. Collecte de données et détermination structurée des cristaux de protéines.
Recueillir l’ensemble complet des données de diffraction des rayons X sur les lignes de faisceau du SSRF du NFPS en utilisant des longueurs d’onde incidentes de 0,978 angström. Traitez initialement les données de diffraction des cristaux à l’aide du logiciel de traitement des données cristallographiques. Effectuez le phasage à l’aide d’un programme de traitement automatique des données.
Utilisez un logiciel de détermination de la structure cristalline pour affiner et optimiser automatiquement le modèle de structure. Troisièmement, la surveillance de l’activité réactionnelle et la détermination des paramètres cinétiques. Surveillance de l’activité DgpA/B/C par HPLC.
Assemblez le système de réaction de clivage du glycoside C dans un tampon PBS, pH 7,4, contenant 20 micromoles par millilitre de DgpA/B/C, un millimole par litre d’ion manganèse, un millimole par litre de NAD, 10 millimoles par litre de DTT et 0,1 millimoles par litre de substrat, puérane, daidzine, génistine. Bien mélanger par pipetage et incuber à 37 degrés pendant huit heures. Ajoutez trois fois la quantité de méthanol dans le système de réaction pour terminer la réaction.
Centrifuger la solution réactionnelle à 16 000 fois g pendant 15 minutes pour éliminer le précipité. Filtrez le surnageant à l’aide d’une membrane filtrante de 0,22 micromètre. Effectuez une analyse HPLC avec élution de gradient à un débit d’un millilitre par minute, des longueurs d’onde de détection de 265 nanomètres et un volume d’injection de 10 microlitres.
Surveillance de l’activité de la DgpA à l’aide d’un dosage du 2,6-dichlorophénol indophénol, DCPIP. Incuber 0,8 millimole par litre de DCPIP, 50 micromoles de protéines par litre et 10 millimoles de protéines par litre de substrat dans un tampon PBS en une seule fois, pH 7,4. Après 20 heures de réaction, enregistrez la variation de l’absorbance de DCPIP à 600 nanomètres à l’aide d’un lecteur de microplaques.
Détermination du taux d’inhibition du glucose sur la réaction de clivage de la liaison C-glycosidique de la puérane. Effectuer la réaction dans un tampon PBS unique, pH 7,4, à différentes concentrations de glucose dans le système réactionnel, comme décrit au point 3.1. Effectuez la réaction à 37 degrés pendant 12 heures.
Effectuer une analyse quantitative des produits générés à l’aide de la HPLC. Détermination des paramètres cinétiques. La concentration de puérarine est fixée de 0,01 à quatre millimoles par litre, et celle de daidzine et de génistine était de 0,01 à deux millimoles par litre dans la réaction de clivage du glycoside C DgpA/B/C.
Effectuer la réaction à 37 degrés pendant huit heures selon la méthode décrite au point 3.1. Dérivez les paramètres cinétiques Km et kcat en ajustant la vitesse de réaction calculée et la concentration du substrat à un modèle de Michaelise-Menten dans Prism. Quatrièmement, préparation et détection du produit intermédiaire de réaction.
Préparation du produit intermédiaire réactionnel. Utilisez de la daidzin et de la genistine comme substrats pour réaliser la réaction selon les méthodes décrites à la section 3.1 avec un système réactionnel de 90 millilitres. Purifier le produit intermédiaire à l’aide d’une HPLC préparative avec une colonne de chromatographie liquide préparative.
Séchez les produits intermédiaires purifiés à l’aide d’un concentrateur centrifuge sous vide pour une utilisation future. Caractérisation du produit intermédiaire réactionnel avec LC-MS. Dissoudre une partie des produits intermédiaires purifiés issus des réactions de daidzine et de génistine dans du méthanol pour préparer des solutions de chaque composé à 50 microgrammes par millilitre.
Centrifugez à 13 500 fois g pendant 10 minutes et collectez les uspernatants pour l’analyse LC-MS/MS. Utilisez le même programme d’élution de gradient que dans l’analyse HPLC pour l’analyse LC-MS avec un volume d’injection de cinq microlitres. Caractérisation d’un produit intermédiaire réactionnel par RMN.
Dissoudre une partie des produits intermédiaires purifiés de la réaction de daidzine dans six deutérés de diméthylsulfoxyde pour la spectroscopie RMN des protons et du carbone 13. Enregistrez les spectres RMN sur un instrument RMN à 400 mégahertz pour un proton. Enregistrer les spectres RMN sur un instrument RMN à 175 mégahertz pour le carbone 13.
Des résultats représentatifs. Dans l’ensemble, nous avons conçu une approche expérimentale combinée qui comprend la production et la purification de protéines, des expériences de cristallisation, des dosages d’activité et l’identification des structures de produits de réaction dans la première figure. Plus précisément, nous avons obtenu des protéines de haute pureté par une chromatographie de purification en trois étapes, une chromatographie d’échange d’ions et une chromatographie de filtration sur gel sur la figure deux.
Dans les expériences de cristallisation, nous avons déterminé les structures cristallines de DgpA et du complexe DgpB/C avec des résolutions de 2,7 angströms et 2,1 angströms, respectivement, dans la figure 3A à D.Nous avons en outre découvert que la DgpA adopte une confirmation auto-inhibée sous sa forme hexamérique dans les figures 3B et C, ce qui a été validé à l’aide du test de réduction DCPIP dans la figure 3F. Ensuite, nous avons constaté que le glucose forme un réseau de liaisons hydrogène avec des acides aminés clés dans la poche de reconnaissance de substrat de DgpA sur la figure 3E. Sur cette base, nous avons conçu des mutants et évalué leur activité de clivage de substrat à l’aide des paramètres cinétiques de la figure 3J.
Il est intéressant de noter que lors du clivage des flavonoïdes O-glycosidiques et des DgpA/B/C, nous avons observé la formation de composés intermédiaires dans les figures 4A et B.Ces intermédiaires ont été identifiés comme des flavonoïdes C-glycosidiques par analyse RMN et LC-MS dans les figures 4C à H, indiquant que DgpA/B/C peut convertir les O-glycosides en C-glycosides.En conclusion. Nous avons été les pionniers de l’intégration de la chimie et de la biotechnologie pour étudier la structure et les caractéristiques fonctionnelles des enzymes métaboliques des glycosides C, démontrant ainsi qu’il s’agit d’une solution raisonnable et pratique. Cette approche comble les lacunes des méthodologies de recherche dans le domaine et peut être facilement appliquée à d’autres gènes ayant des fonctions métaboliques différentes.
Par conséquent, il fournit également un nouveau modèle de référence pour les études futures sur les caractéristiques structurelles et fonctionnelles d’autres protéines fonctionnelles microbiennes intestinales.
