ביולוגיה מבנית וגישות כימיה אנליטית לאפיון אנזימים מטבוליים של C-glycoside במיקרוביוטה של המעי האנושי. פרוטוקול. האחד, ייצור וטיהור חלבון. בניית וקטור ביטוי.
השג את רצף אשכול הגנים GenBank LC422372.1 מ-NCBI. שיבוט הגנים לווקטור pET-28a שונה. הפוך את הפלסמידים לתאים מוכשרים E.coli BL21 DE3.
לאחר מכן תרבית את החיידקים במדיום LB עם 50 מיקרוגרם למיליליטר קנמיצין ב -37 מעלות. הוסף 0.2 מילימול IPTG למדיום כאשר צפיפות החיידקים OD600 מגיעה ל-0.6. תרבית החיידקים בחום של 16 מעלות למשך 16 שעות.
צנטריפוגה את תרבית החיידקים ב -4, 000 פעמים גרם בארבע מעלות. השליכו את הסופרנטנט ושמרו על גלולת החיידקים. השעו מחדש את גלולת החיידקים במאגר A.טיהור חלבון.
הוסף PMSF מילימול אחד להשעיית החיידקים. ליזה את תרחיף החיידקים על ידי מפסק תאים קולי. צנטריפוגה את הליזאט החיידקי ב 48, 000 פעמים גרם למשך 40 דקות בארבע מעלות.
טהר את החלבון בסופרנטנט באמצעות עמודת NTA כרומטוגרפיה של זיקה לניקל. יש לסלק את החלבון הקשור עם Buffer B בשיפוע. אסוף דגימות עם ספיגת UV גבוהה של 280 ננומטר ורצועות חלבון שקופות מ-SDS-PAGE לשלב הבא.
דיאליזה של הדגימות כנגד Buffer C.טהר את החלבון הדיאליזה באמצעות עמודת כרומטוגרפיה של חילופי יונים. קושרים את חלבון המטרה לעמודה עם Buffer C.מסירים את החלבון הקשור עם מרכיב Buffer D. טהר את החלבון באמצעות עמודת אי הכללת גודל עם Buffer E.Collect דגימות חלבון לשלב הבא.
רכז את דגימות החלבון ל -20 מיליגרם למיליליטר, הקפיא אותו במהירות עם חנקן נוזלי. אחסן אותו בחום של 80 מעלות לשימוש עתידי. מדוד את ריכוז החלבון באמצעות QuickDrop עם UV 280 ננומטר.
דיכרואיזם מעגלי, CD, איסוף נתוני ספקטרום. לדלל את החלבונים ל-0.2 מיליגרם למיליליטר בפעם אחת PBS buffer, pH 7.4. הגדר את מהירות הסריקה של המכשיר ל-50 ננומטר לדקה ואת רוחב הפס הספקטרלי לננומטר אחד.
אסוף נתונים ספקטרליים של CD בטווח אורכי הגל של 200 עד 260 ננומטר. הפחיתו את רקע ה-PBS וקחו את הערך הממוצע משלוש מדידות. שתיים, קריסטלוגרפיה של חלבונים וקביעה מובנית.
צמיחה ואופטימיזציה של גבישי חלבון. בצע סינון ראשוני של התגבשות בשיטת ישיבה-טיפה באמצעות ערכות התגבשות החלבון על לוחות גביש של 48 בארות. הגדר את שיפועי המשקעים וריכוז החלבון כדי לייעל את התגבשות החלבון בשיטת הטיפה התלויה.
העבירו גבישים לתמיסת השרייה המכילה מאגר מאגר ותרכובות מטרה ב-16 מעלות למשך 30 דקות לאחר צמיחה מלאה. מעבירים גבישים לתמיסה קריאופרוטקטנטית המכילה מאגר התגבשות בתוספת 25% גליצרול ומאוחסנת מיד בחנקן נוזלי לאיסוף נתונים. איסוף נתונים וקביעה מובנית של גבישי חלבון.
אסוף את הסט השלם של נתוני עקיפה של קרני רנטגן בקווי האלומה של ה-SSRF של ה-NFPS באמצעות אורכי גל תקרית של 0.978 אנגסטרומים. לעבד נתוני עקיפה גבישית בתחילה באמצעות תוכנת עיבוד הנתונים הקריסטלוגרפיים של התוכנית. בצע שלבים באמצעות תוכנית עיבוד נתונים אוטומטית.
השתמש בתוכנה לקביעת מבנה גבישי לחידוד ואופטימיזציה אוטומטיים של מודל המבנה. שלוש, ניטור פעילות תגובה וקביעת פרמטרים קינטיים. ניטור פעילות DgpA/B/C על ידי HPLC.
הרכיבו את מערכת תגובת המחשוף C-glycoside במאגר PBS, pH 7.4, המכיל 20 מיקרומול למיליליטר DgpA/B/C, מילימול אחד לליטר יון מנגן, מילימול אחד לליטר NAD, 10 מילימול לליטר DTT, ו-0.1 מילימול לליטר מצע, puerarin, daidzin, genistin. מערבבים היטב על ידי פיפטינג ודוגרים בחום של 37 מעלות למשך שמונה שעות. הוסף פי שלושה מכמות המתנול למערכת התגובה כדי לסיים את התגובה.
צנטריפוגה את תמיסת התגובה ב 16, 000 פעמים גרם למשך 15 דקות כדי להסיר את המשקעים. מסננים את הסופרנטנט באמצעות קרום פילטר של 0.22 מיקרומטר. בצע ניתוח HPLC עם פליטת שיפוע בקצב זרימה של מיליליטר לדקה, אורכי גל זיהוי של UV 265 ננומטר ונפח הזרקה של 10 מיקרוליטר.
ניטור פעילות DgpA עם 2, 6-דיכלורופנול אינדופנול, DCPIP, בדיקה. דגירה של 0.8 מילימול לליטר DCPIP, 50 מיקרומול לליטר חלבון ו-10 מילימול לליטר מצע במאגר PBS חד פעמי, pH 7.4. לאחר 20 שעות של תגובה, רשום את שינוי הספיגה של DCPIP ב-600 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטות.
קביעת קצב העיכוב של גלוקוז על תגובת מחשוף הקשר C-glycosidic של Puerarin. בצע את התגובה במאגר PBS חד פעמי, pH 7.4, בריכוזים שונים של גלוקוז למערכת התגובה כמתואר בסעיף 3.1. בצע את התגובה ב-37 מעלות למשך 12 שעות.
לבצע ניתוח כמותי של המוצרים שנוצרו באמצעות HPLC. קביעת פרמטרים קינטיים. ריכוז הפוארארין נקבע בין 0.01 ל-4 מילימול לליטר, וזה של דאידזין וג'ניסטין היה בין 0.01 לשני מילימול לליטר בתגובת המחשוף DgpA/B/C C-glycoside.
בצע את התגובה בחום של 37 מעלות למשך שמונה שעות על פי השיטה המתוארת בסעיף 3.1. גזור את הפרמטרים הקינטיים Km ו-kcat על ידי התאמת קצב התגובה המחושב וריכוז הסובסטרט למודל מיכאליס-מנטן בפריזמה. ארבע, הכנה וזיהוי של תוצר ביניים של תגובה.
הכנת תוצר ביניים תגובה. השתמש בדאידזין ובג'ניסטין כמצעים לביצוע התגובה על פי השיטות המתוארות בסעיף 3.1 עם מערכת תגובה של 90 מיליליטר. טהר את מוצר הביניים באמצעות HPLC מכין עם עמודת כרומטוגרפיה נוזלית מכינה.
יבש את מוצרי הביניים המטוהרים בעזרת רכז צנטריפוגלי ואקום לשימוש עתידי. אפיון תוצר ביניים של תגובה עם LC-MS. ממיסים חלק מתוצרי הביניים המטוהרים מתגובות הדאידזין והג'ניסטין במתנול כדי להכין תמיסות של כל תרכובת ב-50 מיקרוגרם למיליליטר.
צנטריפוגה ב-13, 500 פעמים גרם למשך 10 דקות ולאסוף את ה-uspernatants לניתוח LC-MS/MS. השתמש באותה תוכנית פליטת שיפוע כמו בניתוח HPLC לניתוח LC-MS עם נפח הזרקה של חמישה מיקרוליטר. אפיון תוצר ביניים של תגובה עם NMR.
ממיסים חלק מתוצרי הביניים המטוהרים מתגובת הדאידזין בדימתיל סולפוקסיד-דאוטראט שש עבור ספקטרוסקופיה של פרוטון ופחמן 13 NMR. רשום את ספקטרום ה-NMR במכשיר NMR ב-400 מגה-הרץ עבור פרוטון. רשום את ספקטרום ה-NMR במכשיר NMR ב-175 מגה-הרץ עבור פחמן 13.
תוצאות מייצגות. בסך הכל, תכננו גישה ניסויית משולבת הכוללת ייצור וטיהור חלבונים, ניסויי התגבשות, מבחני פעילות וזיהוי מבני תוצרי תגובה באיור 1. באופן ספציפי, השגנו חלבונים בעלי טוהר גבוה באמצעות כרומטוגרפיה של טיהור תלת-שלבי, כרומטוגרפיה של חילופי יונים וכרומטוגרפיה של סינון ג'ל באיור 2.
בניסויי ההתגבשות, קבענו את מבני הגביש של DgpA, ואת קומפלקס DgpB/C ברזולוציות של 2.7 אנגסטרומים ו-2.1 אנגסטרומים, בהתאמה, באיור 3A עד D.גילינו עוד כי ה-DgpA מאמץ אישור מעוכב אוטומטי בצורתו ההקאמרית באיור 3B ו-C, אשר אומת באמצעות מבחן הפחתת DCPIP באיור 3F. לאחר מכן, מצאנו שגלוקוז יוצר רשת קשרי מימן עם חומצות אמינו מרכזיות בכיס זיהוי הסובסטרט של DgpA באיור 3E. על סמך זה, עיצבנו מוטציות והערכנו את פעילות מחשוף המצע שלהם באמצעות פרמטרים קינטיים באיור 3J.
מעניין לציין שבמהלך הפיצול של פלבנואידים O-glycosidic ו-DgpA/B/C, צפינו בהיווצרות תרכובות ביניים באיור 4A ו-B.חומרי ביניים אלה זוהו כפלבונואידים C-glycosidic באמצעות ניתוח NMR ו-LC-MS באיור 4C עד H, מה שמצביע על כך ש-DgpA/B/C יכול להמיר O-גליקוזידים ל-C-גליקוזידים.מסקנה. היינו חלוצים בשילוב של כימיה וביוטכנולוגיה כדי לחקור את המבנה והמאפיינים התפקודיים של אנזימי חילוף החומרים של C-glycosides, והוכחנו שזהו פתרון סביר ומעשי. גישה זו ממלאת פערים במתודולוגיות המחקר בתחום וניתן ליישם אותה בקלות על גנים אחרים בעלי תפקודים מטבוליים שונים.
לכן, הוא גם מספק מודל ייחוס חדש למחקרים עתידיים על המאפיינים המבניים והתפקודיים של חלבונים פונקציונליים אחרים של חיידקי המעיים.
