我们要感谢支持这项工作摆围。安德拉什纳吉博士在西奈山医院，多伦多，安大略省的细胞系的慷慨捐赠。

1。制作Shrinky，丁克模具<ol><li> shrinky，丁克表使用一个很好的定义打印机打印所需的图案。 </li><li>烘烤shrinky丁克表在163℃，约10分钟，或直至完全萎缩，并取得了一个常规的形状。 </li><li> shrinky，丁克模具冷却下来后，把它浸入异丙醇洗澡，直到完整的表面几乎覆盖。 </li><li>小心，喷在模具丙酮和摇晃容器几次。添加更多的异丙醇洗出丙酮过剩，重复此步骤几次，直到shrinky模看上去干净。 </li><li>模具在蒸馏水中浸泡10分钟洗掉任何剩余的有机溶剂。 </li><li>空气清新shrinky模具。再加热5分钟左右，在163 ° C的紧凑型油墨，任何剩余的溶剂蒸发。 </li></ol> 2。使PDMS的微孔<ol><li>准备10:1的PDMS /固化剂混合，搅拌几分钟大力。 </li><li>在一个小培养皿放置shrinky丁克模具。倒入PDMS的混合物，直到它到达了在模具表面约1 / 2厘米。 </li><li>将盘在真空状态下铃PDMS的混合物，以消除所有气泡。 </li><li>放置在烤箱菜在70 ° C，隔夜。 </li><li>切断从固体硅橡胶模具和施加压力，只是绑定到载玻片。 </li><li>第一微孔片丢弃，因为它有油墨残留物之间的PDMS结垢。 </li><li>重复此过程，以便培育出第二代的芯片，它是墨自由和有一个更明确的形状。 </li><li>清洁微孔芯片采用70％乙醇溶液。紫外线光源下放置10分钟消毒。 </li></ol> 3。补漏细胞在微孔<ol><li>计数细胞和培养基稀释到所需浓度（取决于你想多少井的初始细胞）。例如，要获得约10-15％细胞（平均= 11，SD = 5.4，负荷率= 93％），我们用浓度为8 × 10 4细胞/ ml。对于一个17 × 10 4细胞/ ml的浓度，可以可靠地获得25和35之间，每孔细胞（平均= 27.17857 SD = 7.7，负荷率= 100％） 。 </li><li>小心地将50 mL离心管中包含一个固化硅橡胶基地的微孔芯片。 </li><li>新增约2JDP毫升的细胞液。 </li><li>离心5分钟，在760 RPM和4 ° C </li><li>吸取多余的解决方案，并认真洗手，用PBS 1X解决方案的微孔。 </li><li>放置在一个小petry菜的微孔，同时利用离心管芯片小心。 </li><li>使用1 × PBS液洗细胞多余的。 </li><li>微孔芯片置于倒置显微镜下每孔的细胞数，以验证打算。 </li><li>孵育微孔包含在标准条件下的细胞。 <img src="/files/ftp_upload/old/692_2008_7_21_1/692_Figure-01.png" alt="图01" width="350" height="183" /></li></ol> 4。细胞孵育<ol><li>在实验室按照正常的EB协议。 </li><li>慢慢地改变从会议厅一侧的介质，避免干扰细胞中的微孔。 </li></ol>

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	<li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells.">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 7, 862-869 (1995).</li><li>Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+in+vitro+development+of+blastocyst-derived+embryonic+stem+cell+lines:+Formation+of+visceral+yolk+sac,+blood+islands+and+myocardium.">The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).</li><li>Park, J., Cho, C. H., Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A. W., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication-based+modulation+of+embryonic+stem+cell+differentiation.">Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation.</a> Lab Chip. 7, 1018-1028 (2007).</li><li>Koike, M., Sakaki, S., Amano, Y., Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+embryoid+bodies+of+mouse+embryonic+stem+cells+formed+under+various+culture+conditions+and+estimation+of+differentiation+status+of+such+bodies.">Characterization of embryoid bodies of mouse embryonic stem cells formed under various culture conditions and estimation of differentiation status of such bodies.</a> J Biosci Bioeng. 104, 294-299 (2007).</li><li>Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+differentiation+of+stem+cells.">Controlled differentiation of stem cells.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 60, 199-204 (2008).</li><li>Adelman, C. A., Chattopadhyay, S., Bieker, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BMP/BMPR/Smad+pathway+directs+expression+of+the+erythroid-specific+EKLF+and+GATA1+transcription+factors+during+embryoid+body+differentiation+in+serum-free+media.">The BMP/BMPR/Smad pathway directs expression of the erythroid-specific EKLF and GATA1 transcription factors during embryoid body differentiation in serum-free media.</a> Development. 129, 539-549 (2002).</li><li>Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, O. V., Sills, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+blastocyst+dissection+and+subsequent+cultivation+of+embryonic+stem+cells+in+a+serum/cell+free+culture+system:+applications+and+preliminary+results+in+a+murine+model.">Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model.</a> J Transl Med. 4, (2006).</li></ol>

我们已经开发出一种简单，快速，可伸缩的培养方法加载到微井（Shrinky - Dinks成型）预先定义的细胞数目和他们保持胚体的发​​展。最后，这些细胞是方便作进一步的分析和实验。这种方法适合任何实验室，不需要专用的设备，因为我们排除光刻需要。我们可以改变的微孔的大小以及细胞/井的浓度改变胚体的数量和大小。

对于MESC媒体（McCloskey的实验室协议）：（媒体准备总额：50ML;百毫升）KO的DMEM：40.8毫升;81.6毫升15％KSR：7.5毫升;15毫升1X宾夕法尼亚链球菌：0.5毫升;1毫升2mm的L -谷氨酰胺： .5毫升;1毫升NEAA：0.5毫升;1毫升LIF：100ul 200ul BMP - 4（在10ng/ml）：50ul; 100ul摊薄BME：50ul; 100ul（PBS和注射器过滤器5毫升消毒无菌过滤的BME 35ul丢弃2周后的解决方案中的最终浓度是0.1毫米。）

shrinky-dink hanging drops: a simple way to form and culture embryoid bodies

胚体（EB）的胚胎干细胞的聚集。创建这些聚集的最常用的方法是悬滴法，孔板移液到任意数量的细胞费力的方法。被迫彼此接近的干细胞之间的相互作用，促进了EBS的一代。因为在每个井的媒体每天要手动交换，这种做法是手动密集。 此外，因为环境参数，包括细胞，细胞可溶性因子的相互作用，pH值，和氧气供应的EB大小的功能，从传统的挂滴获得的细胞群可以相差很大，即使在相同条件下培养。的确，最近的研究表明，初步形成总额的细胞数量有重大影响干细胞分化。我们已经开发出一种简单，快速，可伸缩的文化的方法加载到预先定义的数字，微型井细胞胚体的发展和维护。最后，这些细胞是方便作进一步的分析和实验。这种方法适合任何实验室，无需专用设备。我们通过这种方法使用红色荧光的小鼠细胞株（129S6B6 F1），胚体。

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Shrinky-Dink Hanging Drops: A Simple Way to Form and Culture Embryoid Bodies

我们展示一个简单而快速的方法加载到预先定义的数字，微型井细胞胚体的发展和维护。

Shrinky丁克挂滴：一个简单的方法，形式和文化胚体

Embryoid bodies (EB) are aggregates of embryonic stem cells. The most common way of creating these aggregates is the hanging drop method, a laborious ...

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