A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

University of Southern California, Los Angeles

This study reports a general method of labeling enveloped viruses with semiconductor quantum dots (QDs) for use in single virus trafficking studies. Retroviruses, including human immunodeficiency virus (HIV), could be successfully tagged with QDs through the membrane incorporation of a short acceptor peptide (AP) that is susceptible to site-specific biotinylation and attachment of streptavidin-conjugated QDs. It was found that this AP tag-based QD labeling had little effect on the viral infectivity and allowed for the study of the kinetics of the internalization of the recombinant lentivirus enveloped with vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVG) into the early endosomes. It also allows for the live cell imaging of the trafficking of labeled virus to the Rab5(+) endosomal compartments. This study further demonstrated by direct visualization of QD-labeled virus that VSVG-pseudotyped lentivirus enters cells independent of clatherin- and caveolin-pathways, while the entry of VSVG-pseudotyped retrovirus occurs via the clathrin pathway. The studies monitoring HIV particles using QD-labeling showed that we could detect single virions on the surface of target cells expressing either CD4/CCR5 or DC-SIGN. Further internalization studies of QD-HIV evidently showed that the clathrin pathway is the major route for DC-SIGN-mediated uptake of viruses. Taken together, our data demonstrate the potential of this QD-labeling for visualizing the dynamic interactions between viruses and target cell structures.

Site-specific labeling of enveloped viruses with quantum dots for single virus tracking.

Cette &eacute;tude d&eacute;crit une m&eacute;thode g&eacute;n&eacute;rale d&#39;&eacute;tiquetage des virus envelopp&eacute;s avec semiconductor quantum dots (QDs) pour utilisation dans les &eacute;tudes de trafic virus unique. Les r&eacute;trovirus, y compris le virus d&#39;immunod&eacute;ficience (HIV), pourraient &ecirc;tre correctement &eacute;tiquet&eacute;s QDs gr&acirc;ce &agrave; l&#39;incorporation de la membrane d&#39;un peptide court accepteur (AP) qui est sensible &agrave; la biotinylation in site et l&#39;attachement des QDs conjugu&eacute; streptavidine. Il a &eacute;t&eacute; constat&eacute; que cet AP repose sur des balises QD &eacute;tiquetage avait peu d&#39;effet sur l&#39;infectivit&eacute; virale et autoris&eacute;s pour l&#39;&eacute;tude de la cin&eacute;tique de l&#39;internalisation de la lentivirus recombinant envelopp&eacute; avec glycoprot&eacute;ine de virus de la stomatite v&eacute;siculeuse (VSVG) dans les endosomes pr&eacute;coces. Il permet &eacute;galement pour l&#39;imagerie de cellules vivantes de la traite des virus &eacute;tiquet&eacute;s aux compartiments endosomale Rab5(+). Cette &eacute;tude a d&eacute;montr&eacute; plus loin par visualisation directe du virus QD marqu&eacute; que VSVG-Pseudo lentivirus p&eacute;n&egrave;tre les cellules ind&eacute;pendantes de clatherin - et cav&eacute;oline-voies, tandis que l&#39;entr&eacute;e de VSVG-Pseudo r&eacute;trovirus se produit via la voie de clathrine. Les &eacute;tudes de surveillance des particules de VIH en utilisant un marquage QD a montr&eacute; que nous pouvons d&eacute;tecter des virions unique &agrave; la surface des cellules cibles exprimant CD4/CCR5 ou DC-SIGN. D&#39;autres &eacute;tudes d&#39;internalisation du QD-VIH montrent &eacute;videmment que la voie de la clathrine est la principale voie pour l&#39;absorption de DC-SIGN-mediated des virus. Globalement, nos donn&eacute;es d&eacute;montrent le potentiel de ce marquage QD pour visualiser les interactions dynamiques entre les virus et les structures de cellules de cible.

In situ de l&#39;&eacute;tiquetage envelopp&eacute; de virus avec des bo&icirc;tes quantiques pour virus unique de suivi.

Questo studio segnala un metodo generale di etichettatura virus avvolto con semiconductor quantum dots (QDs) per l&#39;utilizzo in studi di traffico singolo virus. Retrovirus, tra cui il virus dell&#39;immunodeficienza umana (HIV), potrebbe essere con successo con i tag QDs attraverso l&#39;incorporazione di membrana di un peptide di breve accettore (AP) che &egrave; suscettibile di biotinylation site-specific e l&#39;attaccamento di streptavidina coniugata QDs. Si scopr&igrave; che questo AP basato su tag QD etichettatura ebbe poco effetto sull&#39;infettivit&agrave; virale e permesso per lo studio della cinetica di interiorizzazione del lentivirus ricombinanti avvolto con glicoproteina del virus di stomatite vescicolare (VSVG) nei primi endosomes. Permette anche l&#39;imaging cellulare diretta del traffico di virus etichettati i compartimenti endosomal Rab5(+). Questo studio ha dimostrato ulteriormente dalla visualizzazione diretta del virus QD-etichetta che lentivirus VSVG-pseudotyped entra nelle cellule indipendenti di clatherin-caveolina-percorsi e, mentre la voce di VSVG-pseudotyped retrovirus avviene attraverso la via clathrin. Gli studi di monitoraggio utilizzando QD-etichettatura di particelle di HIV ha mostrato che noi potremmo rilevare singole virioni sulla superficie delle cellule bersaglio che esprime sia CD4/CCR5 o DC-SIGN. Ulteriori studi di interiorizzazione di QD-HIV ha mostrato evidentemente che il pathway clathrin &egrave; la pi&ugrave; importante strada per assorbimento DC-SIGN-mediata del virus. Presi insieme, i nostri dati dimostrano il potenziale di questo QD-etichettatura per visualizzare le interazioni dinamiche tra virus e le strutture delle cellule bersaglio.

Site-specific di etichettatura di avvolto virus con punti quantici per singolo virus tracking.

Membrane fusion plays an essential role in the entry of enveloped viruses into target cells. The merging of viral and target cell membranes is catalyzed by viral fusion proteins, which involves multiple sequential steps in the fusion process. However, the fusion mechanisms mediated by different fusion proteins involve multiple transient intermediates that have not been well characterized. Here, we report a synthetic virus platform that allows us to better understand the different fusion mechanisms driven by the diverse types fusion proteins. The platform consists of lentiviral particles coenveloped with a surface antibody, which serves as the binding protein, along with a fusion protein derived from either influenza virus (HAmu) or Sindbis virus (SINmu). By using a single virus tracking technique, we demonstrated that both HAmu- and SINmu-bearing viruses enter cells through clathrin-dependent endocytosis, but they required different endosomal trafficking routes to initiate viral fusion. Direct observation of single viral fusion events clearly showed that hemifusion mediated by SINmu upon exposure to low pH occurs faster than that mediated by HAmu. Monitoring sequential fusion processes by dual labeling the outer and inner leaflets of viral membranes also revealed that the SINmu-mediated hemifusion intermediate is relatively long-lived as compared with that mediated by HAmu. Taken together, we have demonstrated that the combination of this versatile viral platform with the techniques of single virus tracking can be a powerful tool for revealing molecular details of fusion mediated by various fusion proteins.

Imaging multiple intermediates of single-virus membrane fusion mediated by distinct fusion proteins.

Fusion membranaire joue un r&ocirc;le essentiel dans l&#39;entr&eacute;e des virus envelopp&eacute;s dans les cellules cibles. La fusion de viral et les membranes des cellules cibles est catalys&eacute;e par des prot&eacute;ines de fusion virale, qui implique plusieurs &eacute;tapes dans le processus de fusion. Cependant, les m&eacute;canismes de fusion m&eacute;di&eacute;es par des prot&eacute;ines de fusion diff&eacute;rentes impliquent plusieurs interm&eacute;diaires transitoires qui n&#39;ont pas &eacute;t&eacute; bien caract&eacute;ris&eacute;es. Nous rapportons ici une plateforme de virus synth&eacute;tique qui permet de mieux comprendre les m&eacute;canismes de fusion diff&eacute;rent par les prot&eacute;ines de fusion de divers types. Il s&#39;agit de Particules Lentivirales coenveloped avec un anticorps de surface, qui sert de la prot&eacute;ine de liaison, ainsi que d&#39;une prot&eacute;ine de fusion d&eacute;riv&eacute;e de virus de la grippe (HAmu) ou le virus de Sindbis (SINmu). En utilisant un seul virus, suivi technique, nous avons d&eacute;montr&eacute; que les deux virus renfermant HAmu et SINmu entrer dans les cellules par endocytose clathrine-d&eacute;pendante, mais dont ils avaient besoin endosomale diff&eacute;rents itin&eacute;raires de trafic pour initier la fusion virale. Observation directe d&#39;&eacute;v&eacute;nements unique fusion virale a clairement montr&eacute; que hemifusion m&eacute;di&eacute;e par SINmu lors de l&#39;exposition &agrave; un pH faible se produit plus rapidement que celle v&eacute;hicul&eacute;e par HAmu. Surveillance des processus de fusion s&eacute;quentielle par double marquage les folioles ext&eacute;rieures et int&eacute;rieures des membranes virales a &eacute;galement r&eacute;v&eacute;l&eacute; que l&#39;interm&eacute;diaire de la m&eacute;diation SINmu hemifusion est relativement grande long&eacute;vit&eacute; comparativement &agrave; celle v&eacute;hicul&eacute;e par HAmu. Ensemble, nous avons d&eacute;montr&eacute; que la combinaison de cette plate-forme polyvalente virale avec les techniques de virus unique de suivi peut &ecirc;tre un outil puissant pour r&eacute;v&eacute;ler les d&eacute;tails mol&eacute;culaires de fusion m&eacute;di&eacute;e par diverses prot&eacute;ines de fusion.

Imagerie multiples interm&eacute;diaires de fusion membranaire unique-virus m&eacute;di&eacute;e par des prot&eacute;ines de fusion distincts.

Fusione di membrana svolge un ruolo essenziale nella voce del virus avvolto nelle cellule bersaglio. La fusione di virale e le membrane delle cellule bersaglio &egrave; catalizzata da proteine di fusione virale, che coinvolge pi&ugrave; passaggi sequenziali nel processo di fusione. Tuttavia, i meccanismi di fusione mediati da proteine di fusione diversi coinvolgono pi&ugrave; transitori intermedi che non sono stati ben caratterizzati. Riportiamo una piattaforma virus sintetico che ci permette di comprendere meglio i meccanismi di fusione diversi guidati da proteine di fusione di diversi tipi. La piattaforma &egrave; costituita da particelle lentivirali coenveloped con un anticorpo di superficie, che serve come la proteina, insieme ad una proteina di fusione derivata da virus influenzale (HAmu) o Sindbis virus (SINmu). Utilizzando un singolo virus tecnica di rilevamento, abbiamo dimostrato che entrambi virus HAmu - e SINmu-cuscinetto inserire celle tramite endocitosi clathrin-dipendente, ma hanno richiesto endosomal diverse rotte del narcotraffico per avviare la fusione virale. Osservazione diretta degli eventi unica fusione virale ha mostrato chiaramente che hemifusion mediata da SINmu dopo l&#39;esposizione a basso pH avviene pi&ugrave; velocemente rispetto a quella mediata da HAmu. Monitoraggio dei processi di fusione sequenziale da doppia etichettatura gli opuscoli interni ed esterni delle membrane virali anche rivelato che l&#39;intermedio di hemifusion SINmu-mediata &egrave; relativamente lunga durata rispetto a quello mediato da HAmu. Presi insieme, abbiamo dimostrato che la combinazione di questa versatile piattaforma virale con le tecniche del singolo virus tracking pu&ograve; essere un potente strumento per rivelare dettagli molecolari di fusione mediato da varie proteine di fusione.

Imaging pi&ugrave; intermedi di fusione di membrana singola-virus mediata da proteine di fusione distinti.

Human embryonic stem (hES) cells are renewable cell sources that have potential applications in regenerative medicine. The development of technologies to produce permanent and site-specific genome modifications is in demand to achieve future medical implementation of hES cells. We report herein that a baculoviral vector (BV) system carrying zinc-finger nucleases (ZFNs) can successfully modify the hES cell genome. BV-mediated transient expression of ZFNs specifically disrupted the CCR5 locus in transduced cells and the modified cells exhibited resistance to HIV-1 transduction. To convert the BV to a gene targeting vector, a DNA donor template and ZFNs were incorporated into the vector. These hybrid vectors yielded permanent site-specific gene addition in both immortalized human cell lines (10%) and hES cells (5%). Modified hES cells were both karyotypically normal and pluripotent. These results suggest that this baculoviral delivery system can be engineered for site-specific genetic manipulation in hES cells.

Gene editing of human embryonic stem cells via an engineered baculoviral vector carrying zinc-finger nucleases.

Les cellules souches embryonnaires humaines (hES) sont des sources renouvelables cellules ayant des applications potentielles dans la m&eacute;decine r&eacute;g&eacute;n&eacute;rative. Le d&eacute;veloppement de technologies pour produire des modifications permanentes et sp&eacute;cifiques du g&eacute;nome est demand&eacute; pour r&eacute;aliser une application m&eacute;dicale future de CSEh. Nous rapportons ici qu&#39;un syst&egrave;me de vecteur (BV) baculoviral transportant des nucl&eacute;ases de doigt de zinc (ZFNs) peut modifier avec succ&egrave;s le g&eacute;nome de cellules hES. BV-mediated expression transitoire de ZFNs particuli&egrave;rement perturb&eacute; le locus CCR5 dans les cellules transduits et les cellules modifi&eacute;es expos&eacute;es de r&eacute;sistance &agrave; la transduction du VIH-1. Pour convertir la BV &agrave; un g&egrave;ne cible vecteur, une matrice d&#39;ADN donneur et ZFNs ont &eacute;t&eacute; incorpor&eacute;es dans le vecteur. HES cellules (5 %) et ces vecteurs hybride a donn&eacute; ajout permanent de g&egrave;ne in situ dans les deux lign&eacute;es cellulaires humaines immortalis&eacute;es (10 %). Mis &agrave; jour le CSEh &eacute;tait &agrave; la fois caryotype normal et pluripotentes. Ces r&eacute;sultats sugg&egrave;rent que ce syst&egrave;me de livraison de baculoviral peut &ecirc;tre con&ccedil;u pour des manipulations g&eacute;n&eacute;tiques in site dans les cellules de hES.

G&egrave;ne &eacute;dition de cellules souches embryonnaires humaines via un vecteur machin&eacute; baculoviral transportant des nucl&eacute;ases de doigt de zinc.

Le cellule staminali embrionali umane (hES) sono fonti rinnovabili delle cellule che hanno potenziali applicazioni nella medicina rigenerativa. Lo sviluppo di tecnologie per produrre le modifiche permanenti e site-specific del genoma &egrave; richiesta per raggiungere la futura realizzazione medica delle cellule hES. Segnaliamo qui che un sistema vettoriale (BV) baculoviral che trasportano nucleases zinc-finger (ZFNs) con successo pu&ograve; modificare il genoma della cellula hES. BV-mediata espressione transitoria di ZFNs perturbato in particolare il locus CCR5 in cellule trasdotte e le celle modificate esposto resistenza alla trasduzione di HIV-1. Per convertire il BV un gene targeting vettoriale, un modello di DNA donatore e ZFNs sono state incorporate nel vettore. Questi vettori ibridi ha reso inoltre permanenti site specific gene in entrambe le linee immortalata sulle cellule umane (10%) e hES celle (5%). HES modificato cellule erano entrambi aberrazioni normale e pluripotenti. Questi risultati suggeriscono che questo sistema di consegna di baculoviral pu&ograve; essere progettato per site-specific manipolazione genetica in cellule hES.

Gene modifica delle cellule staminali embrionali umane tramite un vettore di ingegneria baculoviral che trasportano le nucleasi zinc-finger.

The unique spectral properties of semiconductor quantum dots (QDs) enable long-term live-cell imaging and ultrasensitive detection of viral particles, which in turn can potentially provide a practical means for detailed analysis of the underlying molecular mechanisms of virus entry. In this study, we report a general method of labeling adeno-associated virus serotype 2 (AAV2) with QDs for enhanced visualization of the intracellular behavior of viruses in living target cells. It was found that the mild conditions required for this QD conjugation reaction allowed for the retention of viral infectivity of AAV2. Furthermore, quantitative analysis of viral motility in living cells suggested that QD-labeling had no significant effect on the intracellular transport properties of AAV2 particles compared to those of conventional organic dye-labeled AAV2. Our imaging study demonstrated that QD-AAV2 was internalized mainly through a clathrin-dependent pathway and then trafficked through various endosomes. It was also observed that QD-AAV2 particles exploit the cytoskeleton network to facilitate their transport within cells, and the labeling study provided evidence that the ubiquitin-proteasome system was likely involved in the intracellular trafficking of AAV2, at least at the level of nuclear transport. Taken together, our findings reveal the potential of this QD-labeling method for monitoring the intracellular dynamics of virus-host cell interactions and interrogating the molecular mechanisms of viral infection in greater detail.

Enhanced real-time monitoring of adeno-associated virus trafficking by virus-quantum dot conjugates.

Les propri&eacute;t&eacute;s spectrales uniques de bo&icirc;tes quantiques de semi-conducteurs (QDs) permettent &agrave; long terme imagerie de cellules vivantes et d&eacute;tection ultrasensible de particules virales, ce qui peut potentiellement offrir un moyen pratique pour une analyse d&eacute;taill&eacute;e des m&eacute;canismes mol&eacute;culaires sous-jacents de l&#39;entr&eacute;e du virus. Dans cette &eacute;tude, nous pr&eacute;sentons une m&eacute;thode g&eacute;n&eacute;rale d&#39;&eacute;tiquetage s&eacute;rotype du virus adeno-associ&eacute; 2 (AAV2) avec QDs pour am&eacute;liorer la visualisation du comportement intracellulaire des virus dans la vie des cellules cibles. Il a &eacute;t&eacute; constat&eacute; que les conditions douces requises pour cette r&eacute;action de conjugaison QD a permis le maintien de l&#39;infectivit&eacute; virale d&#39;AAV2. En outre, l&#39;analyse quantitative de la motilit&eacute; virale dans les cellules vivantes sugg&egrave;re que QD-&eacute;tiquetage n&#39;eu aucun effet significatif sur les propri&eacute;t&eacute;s de transport intracellulaire des particules AAV2 compar&eacute;es &agrave; celles des classiques AAV2 de marqu&eacute;s au colorant organique. Notre &eacute;tude d&#39;imagerie d&eacute;montr&eacute; que QD-AAV2 &eacute;tait int&eacute;rioris&eacute; principalement par une voie d&eacute;pendante de clathrine et ensuite victimes de la traite par le biais de divers endosomes. On a aussi observ&eacute; que les particules QD-AAV2 exploitent le r&eacute;seau du cytosquelette pour faciliter leur transport dans les cellules, et l&#39;&eacute;tude &eacute;tiquetage fourni la preuve que le syst&egrave;me ubiquitine-prot&eacute;asome &eacute;tait probablement impliqu&eacute; dans le trafic intracellulaire d&#39;AAV2, au moins au niveau du transport de mati&egrave;res nucl&eacute;aires. Pris ensemble, nos r&eacute;sultats r&eacute;v&egrave;lent le potentiel de cette m&eacute;thode QD-&eacute;tiquetage pour le suivi de la dynamique intracellulaire des interactions cellulaires virus-h&ocirc;te et interroger les m&eacute;canismes mol&eacute;culaires de l&#39;infection virale plus en d&eacute;tail.

Am&eacute;lior&eacute; la surveillance en temps r&eacute;el des virus adeno-associ&eacute; traite de virus-quantum dot conjugu&eacute;s.

L&#39;unica propriet&agrave; spettrali di semiconductor quantum dots (QDs) consentono a lungo termine live cell imaging e ultrasensibile rilevazione di particelle virali, che a sua volta pu&ograve; potenzialmente fornire un mezzo pratico per un&#39;analisi dettagliata dei meccanismi molecolari sottostanti di entrata del virus. In questo studio, riportiamo un metodo generale di etichettatura sierotipo del virus adeno-associati 2 (AAV2) con QDs visualizzazione del comportamento intracellulare del virus in vita le cellule di destinazione. Si &egrave; constatato che le condizioni miti necessarie per questa reazione di coniugazione QD consentito per la conservazione di infettivit&agrave; virale di AAV2. Inoltre, analisi quantitativa di motilit&agrave; virale in cellule viventi ha suggerito che QD-etichettatura ha avuto alcun effetto significativo sulle propriet&agrave; delle particelle AAV2 rispetto a quelli convenzionali organici tingere-contrassegnati AAV2 trasporto intracellulare. Il nostro studio di imaging hanno dimostrato che QD-AAV2 &egrave; stato interiorizzato principalmente attraverso una via clathrin-dipendente e quindi trafficate attraverso vari endosomes. &Egrave; stato anche osservato che QD-AAV2 particelle sfrutteranno la rete del citoscheletro per agevolare il loro trasporto all&#39;interno delle cellule, e lo studio di etichettatura fornito prove che il sistema ubiquitina-proteasoma fu probabilmente coinvolto in intracellulare traffico di AAV2, almeno a livello di trasporto nucleare. Presi insieme, i nostri risultati rivelano il potenziale di questo metodo di etichettatura QD per monitorare le dinamiche intracellulare delle interazioni delle cellule virus-ospite e interrogare i meccanismi molecolari dell&#39;infezione virale in maggiore dettaglio.

Migliorato il monitoraggio in tempo reale del traffico di virus adeno-associati da virus-quantum dot coniugati.

Lentiviral vectors (LVs) derived from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) are promising vehicles for gene delivery because they not only efficiently transduce both dividing and non-dividing cells, but also maintain long-term transgene expression. Development of an LV system capable of transducing cells in a cell type-specific manner can be beneficial for certain applications that rely on targeted gene delivery. Previously it was shown that an inverse fusion strategy that incorporated an HIV-1 receptor (CD4) and its co-receptor (CXCR4 or CCR5) onto vector surfaces could confer to LVs the ability to selectively deliver genes to HIV-1 envelope-expressing cells. To build upon this work, we aim to improve its relatively low transduction efficiency and circumvent its inability to target multiple tropisms of HIV-1 by a single vector. We investigated a method to create LVs co-enveloped with the HIV-1 cellular receptor CD4 and a fusogenic protein derived from the Sindbis virus glycoprotein and tested its efficiency to selectively deliver genes into cells expressing HIV-1 envelope proteins. The engineered LV system yields a higher level of transduction efficiency and a broader tropism towards cells displaying the HIV-1 envelope protein (Env) than the previously developed system. Furthermore, we demonstrated in vitro that this engineered LV can preferentially deliver suicide gene therapy to HIV-1 envelope-expressing cells. We conclude that it is potentially feasible to target LVs towards HIV-1-infected cells by functional co-incorporation of the CD4 and fusogenic proteins, and provide preliminary evidence for further investigation on a potential alternative treatment for eradicating HIV-1-infected cells that produce drug-resistant viruses after highly active antiretroviral therapy (HAART).

Engineered lentiviral vectors pseudotyped with a CD4 receptor and a fusogenic protein can target cells expressing HIV-1 envelope proteins.

Vecteurs LENTIVIRAUX (LVs) d&eacute;riv&eacute;s du virus de l&#39;immunod&eacute;ficience humaine de type 1 (VIH-1) sont prometteurs de v&eacute;hicules pour la livraison de g&egrave;ne car ils non seulement transmettre efficacement les cellules en division et non de division, mais maintient aussi l&#39;expression de transg&egrave;nes &agrave; long terme. D&eacute;veloppement d&#39;un syst&egrave;me de LV capable de transduction des cellules d&#39;une mani&egrave;re sp&eacute;cifique au type de cellule peut &ecirc;tre b&eacute;n&eacute;fique pour certaines applications qui reposent sur la livraison de g&egrave;ne cibl&eacute;. Auparavant, il a &eacute;t&eacute; d&eacute;montr&eacute; qu&#39;une strat&eacute;gie de fusion inverse qui a incorpor&eacute; un r&eacute;cepteur du VIH-1 (CD4) et son cor&eacute;cepteur (CXCR4 ou CCR5) sur les surfaces de vecteur pourrait conf&eacute;rer &agrave; LVs la capacit&eacute; d&#39;offrir s&eacute;lectivement les g&egrave;nes pour les cellules exprimant l&#39;enveloppe du VIH-1. Pour inspirer de ce travail, nous visons &agrave; am&eacute;liorer son efficacit&eacute; relativement faible de transduction et de contourner son incapacit&eacute; pour cibler plusieurs Tropismes du VIH-1 par un vecteur unique. Nous avons &eacute;tudi&eacute; une m&eacute;thode pour cr&eacute;er le LVs co-enveloped avec le r&eacute;cepteur cellulaire du VIH-1 CD4 et une prot&eacute;ine fusog&egrave;ne d&eacute;riv&eacute; de la glycoprot&eacute;ine de virus de Sindbis et test&eacute; son efficacit&eacute; pour offrir s&eacute;lectivement les g&egrave;nes dans les cellules exprimant des prot&eacute;ines de l&#39;enveloppe du VIH-1. L&#39;ing&eacute;nierie syst&egrave;me LV conduit &agrave; un niveau plus &eacute;lev&eacute; d&#39;efficacit&eacute; de transduction et un tropisme plus large vers les cellules affichant la prot&eacute;ine d&#39;enveloppe du VIH-1 (Env) que le syst&egrave;me d&eacute;velopp&eacute; pr&eacute;c&eacute;demment. En outre, nous avons d&eacute;montr&eacute; in vitro que ce LV machin&eacute; peut fournir pr&eacute;f&eacute;rentiellement de th&eacute;rapie g&eacute;nique de suicide pour les cellules exprimant l&#39;enveloppe du VIH-1. Nous concluons qu&#39;il est potentiellement possible de cible LVs vers les cellules infect&eacute;es par le VIH-1 par co-incorporation fonctionnelle des prot&eacute;ines CD4 et coniques et fournir des donn&eacute;es pr&eacute;liminaires pour compl&eacute;ment d&#39;enqu&ecirc;te sur un &eacute;ventuel traitement alternatif pour &eacute;radiquer les cellules infect&eacute;es par le VIH-1 qui produisent des virus r&eacute;sistants aux m&eacute;dicaments apr&egrave;s traitement antir&eacute;troviral hautement actif (HAART).

Ing&eacute;nierie des vecteurs LENTIVIRAUX Pseudo avec un r&eacute;cepteur CD4 et une prot&eacute;ine fusog&egrave;ne peuvent cibler les cellules exprimant des prot&eacute;ines de l&#39;enveloppe du VIH-1.

Vettori lentivirali (LVs) derivati dal virus dell&#39;immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1) sono veicoli promettente per la consegna del gene, perch&eacute; non solo efficiente trasdurre dividere e non per dividere le celle, ma anche mantenere a lungo termine espressione del transgene. Sviluppo di un sistema di LV capace di transducing cellule in un modo specifico del tipo di cella pu&ograve; essere utile per alcune applicazioni che si basano sulla consegna del gene bersaglio. In precedenza &egrave; stato dimostrato che una strategia di fusione inversa che incorporava un recettore (CD4) di HIV-1 e il ricettore (CXCR4 o CCR5) sulle superfici di vettore potrebbe conferire a LVs la capacit&agrave; di fornire selettivamente i geni di cellule che esprimono busta HIV-1. Per costruire su questo lavoro, ci proponiamo di migliorare la propria efficienza di trasduzione relativamente basso e aggirare la sua incapacit&agrave; di destinazione pi&ugrave; tropismi di HIV-1 da un singolo vettore. Abbiamo studiato un metodo per creare LVs co-enveloped con l&#39;HIV-1 cellulare recettore CD4 e una proteina fusogena derivato dalla glicoproteina del virus di Sindbis e testato la sua efficacia per fornire selettivamente i geni nelle cellule che esprimono proteine envelope di HIV-1. Il sistema ingegnerizzato LV produce un alto livello di efficienza di trasduzione e un pi&ugrave; ampio tropismo verso cellule visualizzazione proteina HIV-1 busta (Env) rispetto al sistema precedentemente sviluppato. Inoltre, abbiamo dimostrato in vitro che questo LV ingegnerizzati preferenzialmente pu&ograve; consegnare terapia genica suicida in cellule che esprimono busta HIV-1. Concludiamo che &egrave; potenzialmente fattibile a destinazione LVs verso le cellule HIV-1-infected by co-incorporation funzionale delle proteine CD4 e fusogena e fornire prove preliminari per ulteriori indagini su un potenziale trattamento alternativo per eradicare l&#39;HIV-1-infected cellule che producono virus resistenti ai farmaci dopo terapia antiretrovirale altamente attiva (HAART).

Ingegnerizzati vettori lentivirali pseudotyped con un recettore CD4 e una proteina fusogena possono bersaglio le cellule che esprimono proteine envelope di HIV-1.

Vecteurs LENTIVIRAUX (LVs) envelopp&eacute; avec une ing&eacute;nierie Sindbis glycoprot&eacute;ines du virus peut lier sp&eacute;cifiquement aux cellules dendritiques (CD) &agrave; travers la surface r&eacute;cepteurs DC-SIGN et induisent l&#39;expression de l&#39;antig&egrave;ne, fournissant ainsi une m&eacute;thode efficace pour la livraison des vaccins dirig&eacute;s DC. Dans cette &eacute;tude, nous avons construit une ligne de producteurs stables (LV-MGFP) pour la synth&egrave;se de DC-SIGN-cibl&eacute;e ax&eacute;e sur le VIH-1 LVs (DC-LVs) codant la prot&eacute;ine fluorescente verte (GFP) par une technique de transfection concat&eacute;m&egrave;re tableau. Nous avons d&eacute;montr&eacute; que les clones stables &eacute;tablies pourraient produire r&eacute;guli&egrave;rement surnageants de vecteur avec des titres au-dessus de 10 (7) unit&eacute;s de transduction par millilitre (TU/mL) pendant un voyage de cellulaire continue de 3 mois. Les cellules de producteur sont &eacute;galement capables de g&eacute;n&eacute;rer des titres similaires de DC-LVs dans un milieu sans s&eacute;rum. Par ailleurs, l&#39;ajout de 1-d&eacute;soxymannojirimycine (DMJ) a permis les cellules de producteur pour la fabrication de DC-LVs avec titres am&eacute;lior&eacute;es et une activit&eacute; renforc&eacute;e pour &eacute;voquer des r&eacute;ponses des cellules CD8 T antig&egrave;ne-sp&eacute;cifiques chez les souris. Les lignes stables pourraient accueillir le remplacement du promoteur interne murine stem cell virus (MSCV) avec le promoteur de l&#39;ubiquitine-C humaine (Ubi) dans le squelette des g&egrave;nes. Les DC-LVs r&eacute;sultantes portant Ubi pr&eacute;sentait l&#39;activit&eacute; renforc&eacute;e afin d&#39;obtenir l&#39;immunit&eacute; vaccinale sp&eacute;cifique. Selon les preuves accumul&eacute;es, nos &eacute;tudes justifiant l&#39;application de cette m&eacute;thode de production dans la fabrication de DC-LVs pour tester les &eacute;tudes pr&eacute;cliniques et cliniques d&#39;immunisation de base DC roman.

Construction de cellules de producteurs stables pour faire des vecteurs LENTIVIRAUX haut-titre pour la vaccination de base de cellules dendritique.

Lentiviral vectors (LVs) enveloped with an engineered Sindbis virus glycoprotein can specifically bind to dendritic cells (DCs) through the surface receptor DC-SIGN and induce antigen expression, thus providing an efficient method for delivering DC-directed vaccines. In this study, we constructed a stable producer line (LV-MGFP) for synthesizing DC-SIGN-targeted HIV-1-based LVs (DC-LVs) encoding green fluorescent protein (GFP) by a concatemeric array transfection technique. We demonstrated that the established stable clones could routinely produce vector supernatants with titers above 10(7) transduction units per milliliter (TU/mL) during a continuous 3-month cell passage. The producer cells were also capable of generating similar titers of DC-LVs in serum-free medium. Moreover, the addition of 1-deoxymannojirimycin (DMJ) enabled the producer cells to manufacture DC-LVs with both improved titers and enhanced potency to evoke antigen-specific CD8(+) T cell responses in mice. The stable lines could accommodate the replacement of the internal murine stem cell virus (MSCV) promoter with the human ubiquitin-C (Ubi) promoter in the lentiviral backbone. The resulting DC-LVs bearing Ubi exhibited the enhanced potency to elicit vaccine-specific immunity. Based on accumulated evidence, our studies support the application of this production method in manufacturing DC-LVs for preclinical and clinical testing of novel DC-based immunization.

Construction of stable producer cells to make high-titer lentiviral vectors for dendritic cell-based vaccination.

Vettori lentivirali (LVs) avvolti con un Sindbis ingegnerizzati glicoproteina virus specificamente pu&ograve; legare a cellule dendritiche (DCs) attraverso il recettore di superficie DC-SIGN e inducono l&#39;espressione dell&#39;antigene, fornendo cos&igrave; un metodo efficiente per la distribuzione di vaccini DC-diretto. In questo studio, abbiamo costruito una linea stabile produttore (LV-MGFP) per la sintesi di DC-SIGN-mirati basati su HIV-1 LVs (DC-LVs) codifica la proteina fluorescente verde (GFP) mediante una tecnica di transfezione di matrice concatemeric. Abbiamo dimostrato che i cloni stabili stabiliti ordinariamente potrebbero produrre supernatanti vettoriale con titoli di sopra di 10 unit&agrave; di trasduzione per millilitro (TU/mL) durante un passaggio continuo delle cellule di 3 mesi. Cellule del produttore sono stati anche in grado di generare simili titoli di DC-LVs in media serum-free. Inoltre, l&#39;aggiunta di 1-deoxymannojirimycin (DMJ) attivato le cellule del produttore per la fabbricazione di DC-LVs con titoli migliorati e una maggiore potenza per evocare risposte di cellule cellule T antigene-specifiche nei topi. Le linee stabile potrebbero ospitare la sostituzione del promotore interno cellule staminali murine virus (MSCV) con il promotore umana di ubiquitin-C (Ubi) nella spina dorsale lentivirale. Il risultante DC-LVs cuscinetto Ubi esposto la maggiore potenza per suscitare l&#39;immunit&agrave; vaccino specifico. Basata su prove accumulate, i nostri studi supportano l&#39;applicazione di questo metodo di produzione nella produzione DC-LVs per prove di studi preclinici e clinici di immunizzazione romanzo basato su DC.

Costruzione di celle stabile produttore di rendere alto titolo vettori lentivirali per vaccinazione basate sulle cellule dendritiche.

As a consequence of their well-defined nanostructure and intrinsic bioactive functionality, virus-based nanoparticles have shown promise for mediating gene delivery. Adeno-associated virus (AAV) nanoparticles, which possess an excellent safety profile and therapeutic potential, hold potential for use in human gene therapy. However, because of their native tropisms, the applicability of AAV nanoparticles is often limited to restricted ranges of cells or tissues. Thus, retargeting AAV particles to the desired cell populations has continued to be a major research focus in many gene therapy applications. In this study, a general strategy is reported for nanoparticle targeting. This involves the site-specific modification of AAV type 2 (AAV2) by genetically incorporating a short peptide, in this case an aldehyde tag, in the viral capsid. Such a tag can be exploited for site-specific attachment of targeting molecules and allows for further introduction of targeting antibodies or ligands. It is shown that this modification neither affects the level of infectious viral titer nor intracellular trafficking properties. Furthermore, the site-specific conjugation of targeting antibodies could significantly enhance viral transduction to those target cells that have otherwise exhibited very low permissiveness to AAV2 infection. This method also allows the functional incorporation of RGD peptides onto AAV2 for enhanced delivery with implications for cancer gene therapy.

Site-specific modification of adeno-associated viruses via a genetically engineered aldehyde tag.

Par suite de leur nanostructure bien d&eacute;fini et leur fonctionnalit&eacute; bioactive intrins&egrave;que, nanoparticules &agrave; base de virus ont montr&eacute; la promesse pour la livraison de g&egrave;ne de m&eacute;diation. Nanoparticules Adeno-associated virus (AAV), qui poss&egrave;dent un excellent profil d&#39;innocuit&eacute; et potentiel th&eacute;rapeutique, tenir potentiels pour une utilisation en th&eacute;rapie g&eacute;nique humaine. Toutefois, en raison de leurs Tropismes natives, l&#39;applicabilit&eacute; des nanoparticules AAV est souvent limit&eacute;e &agrave; restreints plages de cellules ou de tissus. Ainsi, reciblage des particules AAV aux populations cellule d&eacute;sir&eacute;e a continu&eacute; &agrave; &ecirc;tre un axe de recherche majeur dans de nombreuses applications de la th&eacute;rapie g&eacute;nique. Dans cette &eacute;tude, une strat&eacute;gie g&eacute;n&eacute;rale est signal&eacute;e pour le ciblage de la nanoparticule. Cela implique la modification sp&eacute;cifique de type AAV 2 (AAV2) en incorporant g&eacute;n&eacute;tiquement un peptide court, dans ce cas un ald&eacute;hyde tag, dans la capside virale. Une telle &eacute;tiquette peut &ecirc;tre exploit&eacute;e pour l&#39;attachement sp&eacute;cifique au site de ciblage des mol&eacute;cules et permet outre l&#39;introduction du ciblage des anticorps ou des ligands. Il est d&eacute;montr&eacute; que cette modification affecte ni le niveau de titre virale infectieuse ni propri&eacute;t&eacute;s trafic intracellulaires. En outre, la conjugaison in site du ciblage des anticorps pourrait consid&eacute;rablement am&eacute;liorer la transduction virale aux cellules cibles qui ont manifest&eacute; par ailleurs permissivit&eacute; tr&egrave;s faible &agrave; l&#39;AAV2 infection. Cette m&eacute;thode permet &eacute;galement l&#39;int&eacute;gration fonctionnelle des peptides RGD sur AAV2 pour livraison am&eacute;lior&eacute;e avec des implications pour la th&eacute;rapie g&eacute;nique du cancer.

Modification sp&eacute;cifique au site de virus ad&eacute;no-associ&eacute;s via une balise ald&eacute;hyde g&eacute;n&eacute;tiquement.

Come conseguenza della loro intrinseca funzionalit&agrave; bioattivi e nanostruttura ben definito, virus-ha basato le nanoparticelle hanno dimostrato promessa per la consegna del gene di mediazione. Virus adeno-associati (AAV) nanoparticelle, che possiedono un profilo di sicurezza eccellente e potenziale terapeutico, tengono potenziale per l&#39;uso nella terapia del gene umano. Tuttavia, a causa della loro tropismi nativi, l&#39;applicabilit&agrave; delle nanoparticelle AAV &egrave; spesso limitata alle gamme limitate di cellule o tessuti. Cos&igrave;, retargeting particelle AAV per le popolazioni di cellule desiderata ha continuato ad essere un fuoco di ricerca pi&ugrave; importanti in molte applicazioni di terapia genica. In questo studio, una strategia generale &egrave; segnalata per il targeting di nanoparticelle. Questo comporta la modifica site-specific di tipo AAV 2 (AAV2) incorporando geneticamente un corto peptide, in questo caso un&#39;aldeide tag, le proteine del capside virale. Tale un tag pu&ograve; essere sfruttato per fissaggio site-specific di molecole di targeting e permette ulteriore Introduzione di anticorpi o ligandi di targeting. &Egrave; dimostrato che questa modifica non influisce sul livello del titolo virale infettiva n&eacute; Propriet&agrave; traffico intracellulare. Inoltre, la coniugazione site-specific di targeting anticorpi potrebbe migliorare notevolmente trasduzione virale a quelle cellule bersaglio che hanno esposto altrimenti permissivit&agrave; molto basso di infezione AAV2. Questo metodo consente anche l&#39;integrazione funzionale dei peptidi RGD sul AAV2 per consegna rafforzata con implicazioni per la terapia genica del cancro.

Modifica site-specific di virus adeno-associati tramite un tag aldeide geneticamente ingegnerizzati.

Liposomes constitute one of the most popular nanocarriers for the delivery of cancer therapeutics. However, since their potency is limited by incomplete drug release and inherent instability in the presence of serum components, their poor delivery occurs in certain circumstances. In this study, we address these shortcomings and demonstrate an alternative liposomal formulation, termed crosslinked multilamellar liposome (CML). With its properties of improved sustainable drug release kinetics and enhanced vesicle stability, CML can achieve controlled delivery of cancer therapeutics. CML stably encapsulated the anticancer drug doxorubicin (Dox) in the vesicle and exhibited a remarkably controlled rate of release compared to that of the unilamellar liposome (UL) with the same lipid composition or Doxil-like liposome (DLL). Our imaging study demonstrated that the CMLs were mainly internalized through a caveolin-dependent pathway and were further trafficked through the endosome-lysosome compartments. Furthermore, in vivo experiments showed that the CML-Dox formulation reduced systemic toxicity and significantly improved therapeutic activity in inhibiting tumor growth compared to that of UL-Dox or DLL-Dox. This drug packaging technology may therefore provide a new treatment option to better manage cancer and other diseases.

Crosslinked multilamellar liposomes for controlled delivery of anticancer drugs.

Liposomes constituent l&#39;un des plus populaires nanocarriers pour la prestation de traitements du cancer. Toutefois, &eacute;tant donn&eacute; que leur puissance est limit&eacute;e par la lib&eacute;ration du m&eacute;dicament incompl&egrave;te et instabilit&eacute; inh&eacute;rente en pr&eacute;sence de composants de s&eacute;rum, leur prestation m&eacute;diocre se produit dans certaines circonstances. Dans cette &eacute;tude, nous combler ces lacunes et d&eacute;montrer une autre formulation liposomale, appel&eacute;e liposome multilamellaires r&eacute;ticul&eacute; (CML). Avec ses propri&eacute;t&eacute;s de cin&eacute;tique de lib&eacute;ration am&eacute;lior&eacute;e drogue durable et stabilit&eacute; am&eacute;lior&eacute;e de v&eacute;sicule, LMC peut atteindre des livraisons surveill&eacute;es des traitements du cancer. CML stablement encapsul&eacute; la doxorubicine anticanc&eacute;reux (Dox) dans la v&eacute;sicule et pr&eacute;sente un taux remarquablement contr&ocirc;l&eacute; par rapport &agrave; celle de l&#39;unilamellaires liposome (UL) avec la m&ecirc;me composition lipidique ou Doxil-comme liposome (DLL). Notre &eacute;tude d&#39;imagerie a d&eacute;montr&eacute; que les CMLs &eacute;taient principalement internalis&eacute;s par une voie de cav&eacute;oline-d&eacute;pendante et ont &eacute;t&eacute; davantage victimes de la traite dans les compartiments de l&#39;endosome-lysosome. En outre, les exp&eacute;riences in vivo a montr&eacute; que la formulation de la CML-Dox r&eacute;duit la toxicit&eacute; syst&eacute;mique et am&eacute;lior&eacute; de fa&ccedil;on significative l&#39;activit&eacute; th&eacute;rapeutique dans l&#39;inhibition de la croissance tumorale par rapport &agrave; celle d&#39;UL-Dox ou DLL-Dox. Cette technologie d&#39;emballage de m&eacute;dicament peut donc fournir une nouvelle option th&eacute;rapeutique pour mieux g&eacute;rer le cancer et autres maladies.

R&eacute;ticul&eacute; liposomes multilamellaires pour des livraisons surveill&eacute;es des drogues anticanc&eacute;reuses.

Liposomi costituiscono uno della pi&ugrave; popolare nanoportatori per la consegna delle terapie del cancro. Tuttavia, poich&eacute; la loro potenza &egrave; limitata dalla droga incompleto rilascio e instabilit&agrave; inerente alla presenza di componenti del siero, loro consegna povero si verifica in determinate circostanze. In questo studio, abbiamo affrontare tali carenze e dimostrare una formulazione liposomiale alternativa, chiamati liposomi multilamellari reticolato (CML). Con le sue propriet&agrave; di vescicola maggiore stabilit&agrave; e miglioramento sostenibile farmaco cinetica di rilascio, CML pu&ograve; raggiungere consegna controllata delle terapie del cancro. CML stabile incapsulato la doxorubicina (Dox) di droga anticancro nella vescicola ed esposto un tasso notevolmente controllato di rilascio rispetto a quella dei liposomi unilamellari (UL) con la stessa composizione lipidica o liposoma Doxil-like (DLL). Nostro studio imaging ha dimostrato che il CMLs erano principalmente interiorizzato attraverso un percorso di caveolina-dipendente e sono state ulteriormente trafficate attraverso i compartimenti endosome-lisosoma. Inoltre, gli esperimenti in vivo hanno mostrato che la formulazione di CML-Dox ridotta tossicit&agrave; sistemica e notevolmente migliorata attivit&agrave; terapeutica nell&#39;inibire la crescita tumorale rispetto a quello di UL-Dox o DLL-Dox. Questa tecnologia di confezionamento di droga pu&ograve; quindi fornire una nuova opzione di trattamento per gestire meglio il cancro e altre malattie.

Chi-Lin Lee

Mork Family Department of Chemical Engineering and Materials Science,
Viterbi School of Engineering,
Mork Family Department of Chemical Engineering and Materials Science, Viterbi School of Engineering

University of Southern California, Los Angeles

A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

Chi-Lin Lee

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University of Southern California, Los Angeles

A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

Mork Family Department of Chemical Engineering and Materials Science,
Viterbi School of Engineering,
Mork Family Department of Chemical Engineering and Materials Science, Viterbi School of Engineering