Positive Regulatoren erlauben es einer Zelle, sich durch die Kontrollpunkte des Zellzyklus zu bewegen. Negative Regulatoren spielen eine ebenso wichtige Rolle. Sie können das Fortschreiten einer Zelle in dem Zellzyklus unterbinden oder pausieren, bis bestimmte Kriterien erfüllt sind.

Drei der am besten verstandenen negativen Regulatoren sind p53, p21 und das Retinoblastom-Protein (Rb). Die regulatorische Rolle dieser Proteine wurde entdeckt, als fehlerhaften Kopien in Zellen gefunden wurden, die sich unkontrolliert repliziert haben (Krebs). Diese Proteine üben die meisten ihrer regulatorischen Effekte am Kontrollpunkt G₁ im frühen Stadium des Zellzyklus aus.

P53 beeinflußt die Neigung einer Zelle zur Zellteilung. Der Regulator reagiert auf DNA-Schäden, indem es er den Zellzyklus unterbricht und Enzyme zur Reparatur der Schäden herbeiruft. Wenn ein DNA-Schaden irreparabel ist, kann p53 die Zelle daran hindern, den Zellzyklus zu durchlaufen, indem es die Apoptose bzw. den Zelltod auslöst.

Ein Anstieg von p53 bewirkt die Produktion von p21. P21 verhindert den Übergang der Zelle von der G₁ in die S-Phase des Zellzyklus, indem es an CDK/Zyklinkomplexe bindet und deren positive regulatorische Wirkung hemmt.

Rb reguliert den Zellzyklus negativ, indem es auf verschiedene positive Regulatoren einwirkt. Es reagiert dabei hauptsächlich auf die Größe einer Zelle. Aktives (dephosphoryliertes) Rb bindet an Transkriptionsfaktoren und verhindert so die Initiierung der Gentranskription und folglich der Proteinproduktion.

Wenn Rb an den Transkriptionsfaktor E2F gebunden ist, hemmt es die Synthese von Proteinen, die für den Übergang von der G₁ in die S-Phase benötigt werden. Wenn die Zelle größer wird, wird Rb allmählich phosphoryliert, bis es inaktiviert wird und sich von E2F ablöst. E2F kann dann Gene aktivieren, welche die Proteine produzieren, die für den Übergang in die nächste Phase des Zellzyklus‘ benötigt werden.